[发明专利]间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法

摘要

本发明提供的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，是将新鲜培养基经过滤除菌后送入发酵罐，并向发酵罐接入高密度种子液，控制好所用菌种的有机酸发酵生产条件，当发酵进行至发酵液中残糖量较少时，排出部分或全部发酵液至过滤装置处理，同时补充新鲜的无菌培养基到发酵罐，截留的菌体细胞浓缩液送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的清液用于提取有机酸；仅当有机酸生产率明显下降时，过滤装置截留的菌体细胞浓缩液才不再送回发酵罐，重新向发酵罐补充新的高密度种子液和新鲜的无菌发酵培养基，进行新一轮有机酸的间歇式回流细胞高生产率发酵生产。本发明方法有机酸发酵生产过程中始终保持高生物量和高生产率，具有很好的工业应用价值。

主权项

间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、灭菌：对用于有机酸发酵生产的种子罐、发酵罐、缓冲储罐、过滤装置及其连接管道进行蒸汽或杀菌剂灭菌；步骤二、制备无菌的种子培养基：用经过灭菌的过滤装置对种子培养基进行过滤，得到无菌的种子培养基清液，将该种子培养基清液送入种子罐；步骤三、制备高密度的种子液：根据所要生产的有机酸选择用于有机酸发酵生产的菌种，将所选的菌种接入已装有种子培养基清液的种子罐中，当菌种培养8～60h进入其生长曲线的对数生长期时，将得到的种子培养液用无菌的过滤装置过滤浓缩，使过滤装置截留的种子浓缩液中生物量的干重达到2～30g/L，此种子浓缩液即为高密度种子液；步骤四、制备无菌的发酵培养基：将用于有机酸发酵生产的发酵培养基通过无菌的过滤装置过滤后，得到无菌的发酵培养基清液，将该发酵培养基清液的一部分送入发酵罐，另一部分存放于无菌的缓冲储罐中备用；步骤五、间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：将步骤三所制备的高密度种子液接种到发酵罐内，在有利于所选菌种合成有机酸的发酵条件下进行培养，采用加入碱性中和剂控制pH的方法来解除发酵产酸导致的有机酸反馈抑制，发酵过程中监测发酵罐中发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度降至1.1～10g/L时，同时进行以下(1)和(2)的操作：(1)将发酵液从发酵罐内排出，在发酵液排出的过程中监测发酵罐中发酵液体积的变化，当发酵罐中的发酵液排出了其总体积的30～100％时停止排放，随即向发酵罐中补充新鲜的无菌的发酵培养基清液，补充的新鲜发酵培养基体积不大于排出的发酵液体积，于是，发酵罐中的糖浓度大于发酵液刚从发酵罐内排出时的浓度；(2)将排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，将被过滤装置截留的菌体细胞浓缩液再送回到发酵罐作为生产菌继续使用；当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率没有出现下降时，再次同时进行以上(1)和(2)的操作；当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且不超过10％时，随即向发酵罐内补充用前述步骤三所述方法制备的高密度种子液，并再次同时进行以上(1)和(2)的操作；当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且超过10％时，将发酵罐中的发酵液全部排出，排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回到发酵罐，而是废弃不用，至此即完成一轮完整的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；步骤六、新一轮间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：监测整个生产系统是否出现染菌，当出现染菌时重复上述步骤一至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；当没有出现染菌时，重复上述步骤二至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程。