[发明专利]一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法

摘要

本发明公开了一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控脐血造血干/祖细胞(He)体外扩增的方法，属于生物技术与组织TSPC_S程领域。其特征是将人源成骨细胞使用明胶-海藻酸钠-壳聚糖(GAC)微囊包埋作为基质饲养层细胞，在5％的低氧环境中与脐血HSPCs进行共培养，收获HSPCs。本发明使用GAC微囊将人源成骨细胞与脐血HSPCs隔离开，避免了细胞污染和免疫排斥反应。而微囊的孔道又可使微囊内部成骨细胞分泌的造血生长因子扩散到HSPCs聚集处，起到刺激造血干/祖细胞扩增的作用。而微囊材料本身又对生长因子的扩散起到缓释作用，使得微囊表面生长因子浓度梯度增大，这对于生长因子的长期作用很有帮助。并且，微囊化的成骨细胞形成了3D环境，与贴壁培养的成骨细胞共培养模式相比，一方面可以使培养体系中包含更多的成骨细胞，另一方面也使其具有更大的HSPCs-OBs作用面积。此外，在5％的低氧环境中，共培养体系可以更好的模拟人体骨髓的造血微环境杗iche，成骨细胞对造血干/祖细胞的干细胞特性维持和数量扩增作用都更为显著。

主权项

【权利要求1】一种低氧条件下微囊化成骨细胞支持和调控造血干/祖细胞体外扩增的方法，其特征在于：(1)人源成骨细胞的培养：采用健康儿童源髂骨松质骨，保持无菌，放于盛有PBS缓冲液的培养皿中，用眼科剪剪去除髂骨上的血块和软组织，至无肉眼可见的软组织和血块附着；更换PBS液，剪碎髂骨至约1mm3，用PBS液冲洗，吸去PBS液；将髂骨组织块移至离心管中，加入适量0.25％胰酶消化液，在37℃恒温水浴中搅拌消化15min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；用1mg/ml的II型胶原酶消化，在37℃恒温水浴中搅拌消化90min，加10％新生牛血清DMEM培养液适量，终止消化；1000rpm离心5min后，弃上清；加10％新生牛血清DMEM培养液适量调节细胞浓度为1×105cells/ml浓度接种于T-flasks，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养；待细胞生长至壁面85％融合后，传代两次，即可使用；(2)成骨细胞包囊：取第36代成骨细胞进行共培养实验；用0.25％胰蛋白酶消化23min后用含血清的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心10min，去除上清液，加入2.0％(w/v)明胶溶液重悬，调整细胞密度为2×106cells/ml，在37℃培养箱中孵育30min；按海藻酸钠：明胶＝3∶1的比例加入2.0％(w/v)海藻酸钠溶液，混合均匀，室温下磁力搅拌反应10min，用PBS冲洗三次；然后将胶珠加到0.5％(w/v)壳聚糖溶液中，覆膜反应10min，用PBS冲洗三次，再用IMEM冲洗一次；将微囊加到6孔板中，并添加3mlIMEM，然后将孔板置于培养箱中孵育24h；分别制备两批微囊，放在常氧培养箱和低氧培养箱中；(3)造血干/祖细胞的分离：脐带血采自健康足月分娩产妇；将采集到的含抗凝剂的脐带血缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为2∶1；然后，进行2500rpm25min密度梯度离心，吸取中间白膜层；将吸取到的细胞用含有10％胎牛血清的D-Hank’s平衡盐溶液1000rpm离心5min洗涤两次，之后调整密度接种到培养瓶中备用；在接种到6孔板共培养以前，单个核细胞在培养瓶中过夜；(4)成骨细胞与造血干/祖细胞共培养：调整脐血单个核细胞密度为2×105cells/ml，接种于装有成骨细胞微囊的6孔板中，每孔添加3ml；培养基采用IMEM培养基并补充较低剂量的生长因子组合，包括2.4ng/ml IL-3、10ng/ml FL、20ng/ml SCF、2.0ng/mlGM-SCF和3.2ng/mlTPO；每24h，从6孔板中取出约0.2ml样品，以计总有核细胞密度，检测培养液pH值，葡萄糖和乳酸浓度，在0h和168h时，进行集落形成能力检测；(5)收获造血干/祖细胞：使用PBS清洗成骨细胞微囊，使之和脐血单个核细胞分离；后离心，收获总有核细胞。