[发明专利]一种小鼠胰腺干/祖细胞的离体筛选扩增技术

摘要

本发明公开了一种新型、高效的小鼠胰腺干/祖细胞离体筛选扩增技术，包括小鼠胰腺组织的取材、胰腺单细胞的分离、胰腺干/祖细胞的富集与纯化、胰腺干/祖细胞的大量扩增等步骤。本发明的技术关键是通过胶原酶部分消化富集胰腺干/祖细胞，通过两次转接方法有效地筛除成纤维细胞，最后通过胰蛋白酶点状消化挑取细胞集落的方法纯化胰腺干/祖细胞并大量扩增，最终筛选获得一群均质的，具有强增殖能力及多向分化潜能的胰腺上皮干/祖细胞。

主权项

一种小鼠胰腺干/祖细胞的离体筛选扩增技术，其特征在于：通过胶原酶部分消化、两次转接，挑取细胞集落的方法筛选和扩增出具有强增殖能力及多向分化潜能的成体胰腺干/祖细胞的技术方法。步骤如下：(1)胶原酶部分消化：向剪碎的胰腺组织块中加入0.8mg/ml胶原酶IV消化液及0.1mg/mL的DNA酶I，体积以没过组织为准，37℃孵育20分钟对胰腺组织进行部分消化。(2)胰腺干/祖细胞筛选：用含10％胎牛血清的D/F12培养基重悬细胞沉淀，将胰腺单细胞悬液接种于一个6cm培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养40min，将未贴壁的细胞连同培养基一起转接到2个新6cm培养皿中，培养过夜；24h后，将经过夜培养皿中仍未贴壁的细胞及其培养基一起第二次转接到另外2个新6cm培养皿中，再进行过夜培养，第一次转接过夜培养贴壁的细胞换成扩增培养基(添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100μg链霉素、2％胎牛血清、2％B27、20ng/mL表皮生长因子、10μg/mL胰岛素、50μmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM/F12培养基)继续培养；24h后，弃去第二次转接再过夜培养皿中未贴壁细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养，每3天更换1/2原培养基；扩增培养15d左右。(3)挑取两次转接后获得的大上皮细胞集落进一步筛除成纤维细胞：10μL枪头吸取3～5μL 0.125％胰蛋白酶消化液，对准两次转接后获得的一个大上皮细胞集落(300～500个细胞大小)进行点状消化，吸打8～15次，收集细胞接种于48孔板培养孔中，加入含10％胎牛血清的D/F12培养基，吸打均匀，37℃5％CO2培养箱中培养过夜。24h后，弃去孔板中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养。