[发明专利]在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法

摘要

本发明提出了一种利用麦芽糖结合蛋白与细菌漆酶融合形成麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白并在低温下进行表达的技术方法，其步骤为：A、麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶基因的构建，B、阳性转化子的筛选，C、融合蛋白的表达，D、可溶性融合蛋白的鉴定，E、融合蛋白的纯化，F、漆酶酶动力学参数测定。本发明实现了在大肠杆菌细胞内高效表达麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白。可溶性细菌漆酶不仅可高效表达而且还保持与未融合细菌漆酶相同的酶活力。克服了细菌漆酶在大肠杆菌细胞内高效表达时形成大量的不溶性包涵体的问题。该方法操作简单、发酵时间短、节约成本。还可以直接将细菌漆酶固定在麦芽糖亲和层析树脂上进行各种酶催化反应。

主权项

在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法，其特征在于包括以下步骤：A、麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶基因的构建：(1)在50μl的体系中，加入5μl 10×限制性内切酶反应缓冲液，并按1μgDNA：3-5U限制性内切酶的比例加入DNA和限制性内切酶，混匀后37℃保温2-12小时，使用该方法分别用相同的限制性内切酶消化切割pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA；(2)用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段；(3)在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA，再加入1μlT4DNA连接酶，16℃水浴4-12小时将细菌漆酶基因插入pMAL-c2x质粒上的多克隆位点，使细菌漆酶基因连接在pMAL-c2x质粒上携带的麦芽糖结合蛋白基因malE的后面，形成一个重组表达质粒；B、阳性转化子的筛选：利用常规的CaCl2法制备E.coli DH10B感受态细胞，然后将5-10μl连接反应混合物与100μl E.coli DH10B感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟，加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养12小时，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；新鲜LB培养基组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、加水至1L(pH7.0；LB平板组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、琼脂1.5g、加水至1L(pH7.0))；C、融合蛋白的表达：将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的摇瓶中20℃摇动培养，摇床转速为250rpm，当OD600值达到0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导6-8小时，细胞经4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl缓冲液中(pH7.4)，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液；D、可溶性融合蛋白的鉴定：取10-15μl上清液上样，经10％SDS-PAGE电泳120V、1.5小时后，考马斯亮蓝染色1小时，与单一细菌漆酶基因表达的可溶性漆酶蛋白(＜10％)相比，可溶性融合酶蛋白的比例提高到65％以上；E、融合蛋白的纯化：将50ml上清粗酶液与10ml麦芽糖亲和层析树脂混合，4℃缓慢摇动4-12小时，然后将混合物装柱并用缓冲液A平衡，流速为1ml/min，用缓冲液A洗柱10-15个床体积后，再用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液，目的蛋白经10％SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后的蛋白经65％硫酸铵沉淀浓缩后再用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析去除残余的硫酸铵，在实验室摇瓶发酵条件下，从培养物中可获得纯蛋白；缓冲液A为20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl，缓冲液B为20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl、10mM麦芽糖；F、酶动力学参数测定：使用漆酶底物ABTS(2，2’-联氮基-双(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)检测，麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的细菌漆酶相似的酶动力学参数，以DMP为底物时，反应体系为50mM TrisHCl(pH8.0)、0.2mM CuSO4和浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.6、1mM的DMP，以ABTS为底物时，反应体系为50mM醋酸缓冲液(pH3.0)、0.2mMCuSO4和浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2mM的ABTS，在反应体系中加入1-5μl适量稀释的纯酶后启动反应，用MV-2550型紫外分光光度计在37℃条件下测定酶动力学参数Km、Vmax和Km/Vmax值。