[发明专利]一种重组鸭α -干扰素的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组鸭α-干扰素的制备方法，属于生物制药技术领域。该方法包括：(1)鸭α-干扰素基因合成；(2)引物的设计和合成；(3)表达载体的构建；(4)工程菌的诱导表达；(5)表达产物的提取、纯化、复性；(6)生物学活性测定等步骤组成。本发明重组鸭α-干扰素制剂纯度达90％以上，每毫升细胞半数保护量达105u以上，经临床应用其相对治愈率达93％以上，且其价格低廉，为鸭病毒性肝炎治疗提供了一种安全有效，无毒副作用的新药剂，具有良好的社会效益和应用前景。本发明可在鸭养殖场和禽用制药企业推广应用。

主权项

1.一种重组鸭α-干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行：(1)鸭α-干扰素基因合成：将Genebank公布编号为X84764的鸭α-干扰素基因序列进行合成；(2)引物的设计和合成：根据鸭α-干扰素基因序列设计用于扩增鸭a-干扰素成熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5`端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物对的序列为：上游引物P1：5`-ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3`下游引物P2：5`-GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3`(3)表达载体的构建：以合成的鸭α-干扰素基因为模板，用P1、P2引物扩增出鸭a-干扰素成熟蛋白基因，经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET-28a(+)BamHI和EcoRI的酶切位点，再转化入受体菌E.coliBL21-plsS，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验证正确后作为工程菌保存；(4)工程菌的诱导表达：将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液，37℃培养过夜，次日将该菌液按2％的接种量接种与上述相同LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值为0.6～0.7；加入最终浓度为1mmol的IPTG诱导剂诱导培养4h；取菌液4000转离心10min收集菌体，置-70℃冰箱保存，备用；(5)表达产物的提取、纯化、复性：将菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mMNaCl、10mMβ-巯基乙醇配制，pH7.8的裂解buffer按重量1∶4比例重悬；用高压均质机在650帕压力下，重复裂解两次，13000转、离心20分钟，得沉淀物即提取的包涵体；将包涵体与由6M盐酸胍、100mMNaH₂PO₄、10mMTris-HCl、10mMβ-巯基乙醇配制，pH8.0的溶解buffer按重量1∶10比例用超声波重悬，室温下作用90min，10000转离心30min后，取上清液过镍柱纯化，得带有组氨酸标签的纯度达90％以上的目的蛋白；将纯化后的目的蛋白装入透析袋，先在由2M尿素、50mM醋酸缓冲液、10mMβ-巯基乙醇、50mMNaCl配制，pH3.6的缓冲液1中透析复性24小时，10000转离心10min，取上清液；再在由50mM醋酸缓冲液、50mMNaCl配制，pH3.6的缓冲液2中透析复性48小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α-干扰素；(6)生物学活性的测定：采用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水泡性口炎病毒VSV检测粗制重组鸭α-干扰素的生物学活性，其生物学活性为每毫升细胞半数保护量达10⁵u以上，即为重组鸭α-干扰素成品。