[发明专利]大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法

摘要

本发明属于生物制氢技术，一种大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法。现有莱茵衣藻制氢的缺点是：莱茵衣藻氢酶对氧气敏感，容易受氧气的抑制而失去活性；限制了衣藻的产氢效果。本发明公开了一个豆血红蛋白球蛋白亚基基因在莱茵衣藻产氢中的应用，将豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba构建在莱茵衣藻叶绿体表达载体中，并将该表达载体转入莱茵衣藻叶绿体中，使lba基因在莱茵衣藻叶绿体中表达。转化的莱茵衣藻的密闭培养体系中氧气含量下降明显比未转基因莱茵衣藻快，并且氧气含量能维持较低水平，产氢量明显增加；本发明方法适用于所有产氢的微藻。

主权项

1.大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法，步骤如下：(1)莱茵衣藻的培养：A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；B、培养莱茵衣藻藻种：(a)液体培养基：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米.秒(μmol photons m^-2s^-1)；50～100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m^-2s^-1)，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；D、用GC测定氢气和氧气含量：气相色谱仪为美国Agilent Technologies公司生产的7890A型号，分子筛51/8(OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0.5ml，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；(2)豆血红蛋白球蛋白亚基1ba基因的克隆：A、取大豆成熟的根瘤液氮研磨，提取大豆的总RNA；用DNA水解酶DNase I37℃水浴30min，去除RNA中混杂的DNA；加入25mM乙二胺四乙酸，65℃水浴10min，终止DNA水解酶的活性；37℃水浴60min合成单链cDNA；B、用DNA聚合酶(ExTag)进行聚合酶链式反应(PCR)克隆大豆1ba基因，反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30个循环；72℃延伸10min，反应产物纯化回收；C、测序鉴定1ba基因的特异性引物：Lba-P1：5’-c gag ctcaaa ttt aaa ttt atg gtt gct ttc act gag-3’，斜体表示限制性内切酶SmalI的酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的核糖体结合位点RBS序列；Lba-P2：5’-tcc ccc ggg ata cta att atg cct tct taa tag c-3’，斜体表示限制性内切酶SacI酶切位点序列；(3)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：用限制性内切酶SmalI和SacI来酶切克隆得到的大豆1ba基因片段和叶绿体表达载体cg40；将1ba基因片段用T4 DNA连接酶连接在质粒cg40中的壮观霉素抗性基因aadA之后形成aadA-1ba融合基因，得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-1ba，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，经限制性内切酶SmalI和SacI双酶切鉴定，得到442bp的1ba片段和5900bp的质粒片段；(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃下3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m^-2·s^-1)和25±1℃条件下培养24小时；用基因抢轰击转化；真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-1ba DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，在25±1℃和100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons·m^-2·s^-1)的连续光照条件下，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；(5)转基因莱茵衣藻中1ba基因的整合及其表达：A、1ba基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：取对数生长后期衣藻培养液，4℃低速离心收集，加入350μlNET的0.1mol/L氯化钠，50mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.020mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸重悬沉淀，加入25μl10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％十二烷基硫酸钠(SDS)，混合均匀，37℃水浴12小时，冷却；加入200μl 5mol/L醋酸钾(KAc)，冰上静置、离心，上清液中加入等体积的25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇抽提2次；再用等体积的氯仿抽提1次；总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，简称TE)缓冲液；B、转基因莱茵衣藻中1ba基因转录的检测：取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞；提取莱茵衣藻的总RNA和合成cDNA；利用上述1ba基因的特异性引物和上述克隆1ba基因所述的PCR条件进行扩增，进行1ba基因转录水平的检测，得到442bp的扩增条带；C、转基因莱茵衣藻中Lba表达量的检测：取产氢培养的莱茵衣藻培养液，室温3000rpm快速离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μlβ-巯基乙醇，液氮冻融三次；在4℃条件下，14000g离心20min，取100μg的蛋白上清液加上0.25摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸配制的缓冲液(Tris-HCl)，pH 8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸钠(SDS)；0.25mg/ml溴酚兰(bromophenolblue)；12.5％(v/v)β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)于10％的分离胶和5％的浓缩胶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，抗大豆Lba多克隆抗体进性免疫杂交检测，对辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase，简称HRP)标记的抗体进行化学发光检测；(6)分析重组豆血红蛋白球蛋白亚基Lba对莱茵衣藻生长的影响：A、用TU-1901双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃下12000rpm离心10min；取上清，测定OD665及D649的吸光值；C、计算叶绿素a，叶绿素b及总叶绿素的含量，单位mg/L：叶绿素Chl(mg/l)＝20.04(OD₆₄₉)+6.10(0D₆₆₅)；(7)分析豆血红蛋白球蛋白亚基Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：A、缺硫培养基中耗氧量和产氢量的检测：B、含硫培养基中对耗氧量和产氢量的检测。