[发明专利]一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法

摘要

本发明涉及一种大豆异黄酮的制备方法，尤其是公开了一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，利用工程菌发酵底物产生异黄酮为大豆异黄酮的来源提供了新的途径，而且克服了传统大豆异黄酮工业受含量低和大豆原料本身的熟期限制。本发明所用的乳酸乳球菌为安全的食品级微生物，质粒pNZ8149以LacF基因取代了常用的抗生素抗性基因作为筛选标记，其宿主菌乳酸乳球菌NZ3900已删除lacF基因，避免了抗生素抗性基因的水平转移，更加安全，符合临床应用要求，为将来工业开发利用工程菌代谢生产异黄酮开辟了应用前景。

主权项

一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：1)设计引物根据GenBank已发表的大豆异黄酮合成酶基因IFS1的DNA序列，应用PrimerPremier5.0设计引物引物如下：上游引物：5′TT ACTAGT ATGTTGCTTGAACTTGCACTTGGTTTG  3′(SpeI)下游引物：5′TT TCTAGA TTAAGAAAGGAGTTTAGATGCAACGCCG 3′(XbaI)2)提取大豆吉农17的总RNA，反转录成CDNA；3)扩增大豆异黄酮合成酶基因IFS1，构建重组克隆载体pMD18-T-IFS1并进行鉴定；4)构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFS1，利用电穿孔方法将重组表达载体pNZ8149-IFS1转入到乳酸乳球菌NZ3900中，获得重组乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1并进行鉴定；5)提取乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1的粗蛋白，利用SDS-PAGE方法对乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1进行蛋白检测；6)以大豆异黄酮之一染料木黄酮作为标准品，利用高效液相方法检测工程菌发酵生产大豆异黄酮：利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1发酵柚皮素产生大豆异黄酮；也可以应用含有柚皮素的自然添加物作为底物利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1发酵生产大豆异黄酮。