[发明专利]一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒

摘要

一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，通过提取发光杆菌的总DNA，以此为模板PCR扩增plu2935和plu2936基因，将plu2935和plu2936基因克隆入pET32a载体，构建获得重组酶表达载体pET-plu，将pET-plu导入BL21(DE3)中，获得可表达重组酶Plu2935和Plu2936的工程菌BL21-REC。IPTG诱导BL21-REC，表达Plu2935和Plu2936重组酶，并制备成感受态细胞。将含有同源序列的两DNA片段工转化入BL21-REC感受态细胞，在相应抗性平板上筛选获得含重组DNA的转化子。

主权项

1.一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步：(1).引物设计与PCR扩增：Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/1kbDNA)，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物，因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难，引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降；(2).DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞：将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl₂溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。