[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir与Tccp的重组蛋白

摘要

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(Tccp)重组蛋白的制备方法及应用，属于生物技术领域。取tir和tccp基因C端序列串联克隆，获得pGEM-T-tir-tccp重组质粒，构建重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp，转化入感受态细胞BL21(DE3)中，获得重组菌株，经IPTG诱导后获得高效表达。本发明制备的重组蛋白Tir-Tccp具有良好的免疫原性，可诱导机体产生高滴度的保护性抗体。Tir-Tccp可作为研制亚单位疫苗的候选多价融合蛋白，为预防和治疗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染提供了技术平台和防控手段。

主权项

肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7转位紧密素受体Tir与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白TccP重组蛋白，其特征在于，是由以下方法获得的：(1)获取tir和tccp基因C端序列，并串联克隆入pGEM-T载体设计并合成两对特异性引物，以O157:H7EDL933制备的DNA为模板，分别扩增tir和tccp基因C端1243bp和825bp序列，引物序列如下：Tir-P1：5’-tacggatccactcttaacaggcagattgg-3’Tir-P2：5’-cgaaagcttcgttatcagtagtatccc-3’TccP-P1：5’-accaagcttcccattcggcatcatttc-3’TccP-P2：5’-cggctcgaggcttagatgtattaatgcc-3Tir-P1和TccP-P2引物两端分别加限制性酶切位点BamH I和XhoI及保护性碱基，Tir-P2和TccP-P1引物两端加同样的限制性酶切位点Hind III及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，tir/tccp基因PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃1min，60℃/58℃1min，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，以双蒸水为阴性对照；Tir-P1和Tir-P2、TccP-P1和TccP-P2两对引物扩增获得相应大小的目的条带为1243bp和825bp，并分别用质量：体积比1％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的Extraction buffer后56℃作用10min，转移融化的液体于2mL微型柱子，并6000g离心1min，弃液体，加入500ul的Extraction buffer，12000g离心30s，再弃液体，加入wash buffer 750ul，12000g离心30s，弃液体，空管12000g离心30s，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入30ul Elution buffer，12000g离心30s，收集离心液，即为经过纯化的1243bp和825bp片段，命名为tir414和tccp275片段；将Hind III酶切tir414和tccp275片段各1.6μL，T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1.0μL，双蒸水4.8μL同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取tir414-tccp275的过夜连接产物3.0μL，与2×Rapid Ligation Buffer5.0μL、T4 DNALigase 1.0μL和pGEM-T载体1.0μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接18h-24h，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切，37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条2068bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pGEMT-tir414-tccp275；(2)pGEX-4T-1-tir-tccp重组质粒的构建pGEMT-4T-1-tir414-tccp275重组质粒和表达载体pGEX-4T-1质粒分别用BamH I、Xho I双酶切，回收tir-tccp重组基因和pGEX-4T-1酶切片段，T4DNA酶连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp，连接反应体系：10×T4 DNA Ligasebuffer1.0μL，T4DNA Ligase1.0μL，pGEX-4T-1酶切片段3.0μL，目的片段1.2μL，灭菌ddH2O 3.8μL。上述试剂混匀后于4℃连接18h～24h，将连接产物转化于感受态BL21(DE3)中，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Xho I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可出现2068bp片段，即获阳性重组菌质粒BL21(pGEX4T-1-tir-tccp)；(3)Tir-TccP重组融合蛋白的表达挑取经过酶切鉴定为阳性的单菌落，37℃振荡培养过夜，同时转化pGEX-4T-1空质粒做阴性，将培养菌液按体积比2％接种于Amp工作浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600≈0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，之后在30℃继续培养7h进行诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE，诱导菌液离心收集菌体重悬于PBS缓冲液中，超声裂解后，10000g离心20min，收集上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，以确定表达目的蛋白存在形式，在上清中可以清晰看到分子量大小为102kD目的蛋白，表明表达蛋白主要以可溶性形式存在于菌体蛋白中，即为Tir-TccP重组蛋白。