[发明专利]一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用

摘要

一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料制备C57BL/6J_4.1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化C57BL/6J_4.1R-/-MEF。本发明的目的是为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选和基因治疗提供离体细胞筛选模型。其优点在于：避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等对以4.1R为治疗靶的药物筛选和生产产生的局限。降低靶向新药生产成本。本发明所建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF，细胞表面CD29活化由于4.1R的缺失而被抑制，可以成为生产以CD29为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗肿瘤新药的筛选模型。

主权项

一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养①取C57BL/6J_4.1R-/-小鼠胚胎，去除头、心脏和肝脏，其余部分用PBS洗涤3次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0.25％冷胰蛋白酶，4℃过夜；②6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，37℃水浴30min，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀1min，将上清移到一只新的无菌离心管中，而沉淀加入新的DMEM培养基，重复该分离步骤；③将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10mlDMEM培养基重新悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37℃5％CO2培养箱内培养过夜；④6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1∶5传代；(2)小鼠胚胎成纤维细胞永生化①865细胞(ATCC Number：CRL-7601)在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10min，收集上清后，进行滤膜过滤，滤液按1∶5000加入聚凝胺备用；②将5×105个传至第3代的MEF细胞加入5ml上述含聚凝胺的SV40病毒大T抗原滤液中，培养24h后弃培养液，换成DMEM正常培养基进行传代培养；③培养至10代后，液氮罐中冻存。