[发明专利]逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测

摘要

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、抑制TGF-β1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白，其特征在于：应用TGF-β1通路抑制蛋白SARA，将其与穿膜蛋白结构域(PTD)融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型TGF-β1通路抑制剂SARA高效低毒的优点，又能有效的穿过细胞膜和核膜，从而降低TGF-β1通路抑制剂的临床用药量，增强其在逆转肾脏纤维化治疗中的作用，可望获得临床治疗肾脏纤维化的新型多肽药。

主权项

逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：它包括1)合成含酶切位点编码PTD-SARA的基因序列；2)PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外穿膜活性检测；即重组PTD-SARA穿过HKC细胞胞膜和核膜的能力；加入不同剂量的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，检测其在细胞内胞浆和胞核中的表达量；6)重组蛋白的体外生物学活性检测：即重组PTD-SARA抑制TGF-β1对人肾小管上皮细胞HKC转分化的影响；加入不同剂量的重组PTD-SARA，再用TGF-β1刺激HKC细胞，观察细胞形态和表皮细胞标志物E-cadherin的表达以及间皮细胞标志物α-SMA表达量；7)重组蛋白的体内生物学活性检测：按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。