[发明专利]抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法

摘要

本发明涉及抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法。其包括以下操作步骤：(1)用牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株培养分离取得牙龈卟啉单胞菌；(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白；(3)以牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原与福氏不完全佐剂混匀成静脉注射剂，对产蛋母鸡鸡翅下静脉注射，收集所产鸡蛋；(4)提取鸡蛋中的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白。本发明生产成本低，产出率高，一个鸡蛋可以获得100毫克的卵黄免疫球蛋白；该方法操作简便快捷，并具有耐热、耐酸、稳定性好等优点。在温度不高于75℃和在pH4以上的酸性环境中，仍能很好地保持其生物学活性，常温下可以储存3个月左右，4℃可以保存6-12个月而抗体活性不下降。

主权项

抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)牙龈卟啉单胞菌的培养和鉴定用牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株培养分离取得牙龈卟啉单胞菌备用；(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白将分离出的牙龈卟啉单胞菌在牛脑心浸液(BHI)羊血液体培养基中37℃，80％氮气(N2)、10％二氧化碳(CO2)、10％氢气(H2)增菌厌氧培养48h，收集细菌，超声震碎至90％细胞完全破碎，4000r/min×10min离心，收集上清液，即为牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原，温度4℃保存备用；(3)蛋鸡免疫选5个月龄的未免疫的健康罗曼产蛋母鸡，隔离饲养；以1mg/ml牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原1ml与福氏不完全佐剂1ml吹打混匀成油包水状静脉注射剂，对上述产蛋母鸡鸡翅下静脉注射，每只鸡注射量为0.5mg；每周注射免疫一次，共注射免疫4次；同时，收集每天产下的鸡蛋，温度4℃保存；(4)提纯抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)用卵黄免疫球蛋白纯化系统试剂盒(EGG stractTM IgY Purification System，Promega公司，美国)提纯每天产下鸡蛋的卵黄免疫球蛋白，所述试剂盒包括试剂盒A液和试剂盒B液，具体操作如下：a、将蛋黄和蛋清分开，收集蛋黄，缓慢加入蛋黄3倍体积的试剂盒A液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，收集上清液；b、在上清液的中加入1/3体积的试剂盒B液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清液，用无菌PH值7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀处理，取得沉淀物；c、在沉淀物中加入1/3体积的试剂盒B液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清，用无菌PH值7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，获得高纯度的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白，4℃保存；抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白的相对分子质量约为180，所含的2个亚单位即65～70的重链和22～30的轻链。