[发明专利]导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法

摘要

导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法，它涉及大豆根瘤菌基因工程菌株的构建方法。它解决了现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量的增加少，对大豆产量增幅小的问题。方法：提取大豆根瘤菌基因组DNA，进行PCR扩增，得目的基因nifA，纯化后与TA克隆载体pMD18-T进行连接，得连接产物，再转化大肠杆菌；经过多次酶切、连接和验证，获得重组原核生物表达载体pTR-Plac-nifA；将原核生物表达载体pTR-Plac-nifA转化到大豆土著根瘤菌中即完成。本发明中菌株HD-SFH-01，在接种到大豆幼苗后，结瘤数量增加，大豆产量增加3.80％。

主权项

导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法，其特征在于导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法按以下步骤进行：一、对快生型大豆根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifA，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit进行纯化，再将纯化后的目的基因nifA与TA克隆载体pMD18-T进行连接，获得连接产物；三、将连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用碱裂解法提取质粒载体pUC19，再将目的基因nifA与质粒载体pUC19分别经SacI和SalI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pUC19-nifA；四、以重组载体pUC19-nifA为模板进行PCR扩增，获得Plac-nifA片段，然后将Plac-nifA片段与pET-28a质粒载体分别经NcoI和SacI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pET-28a-Plac-nifA；五、以重组载体pET-28a-Plac-nifA为模板进行PCR扩增，获得Plac-nifA-T7片段，然后将Plac-nifA-T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组原核生物表达载体pTR-Plac-nifA；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plac-nifA转化到大豆土著根瘤菌中，即完成导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGTCGACTTATGACTGAATTATCC-3’，下游引物为5’-CGCGAGCTCACCGAATTTAGATCTT-3’；步骤四中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCCCATGGATTACCGCCTTTGAGT-3’，下游引物为5’-CGCGCGGCCGCTGCAAGGCGATTAA-3’；步骤五中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGGTACCATTGTGAGCGGATAAC-3’，下游引物为5’-GCGGGTACCTAGTTCCTCCTTTCAG-3’。