[发明专利]导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法

摘要

导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法，它涉及大豆根瘤菌工程菌株的构建方法。它解决了现有大豆根瘤菌工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量少，对大豆产量增幅小的问题。方法：提取大豆根瘤菌基因组DNA，进行PCR扩增，得目的基因nodD，纯化后与TA克隆载体pMD18-T进行连接，得连接产物，再转化大肠杆菌；经过多次酶切、连接和验证，获得重组原核生物表达载体pTR-Plac-nodD；将原核生物表达载体pTR-Plac-nodD转化到大豆土著根瘤菌中即完成。本发明中菌株HD-SFH-02，在接种到大豆幼苗后，结瘤数量增加23.73％，大豆产量增幅大。

主权项

导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD‑SFH‑02的构建方法，其特征在于导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD‑SFH‑02的构建方法按以下步骤进行：一、对快生型大豆根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nodD，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit进行纯化，再将纯化后的目的基因nodD与TA克隆载体pMD18‑T进行连接，获得连接产物；三、将连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用碱裂解法提取质粒载体pUC19，再进行PCR扩增，获得lac启动子，然后lac启动子和质粒载体pET‑28a分别经BglII和Nco I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒载体pET‑Plac；四、将目的基因nodD与重组质粒载体pET‑Plac分别经Nco I和Xho I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pET‑Plac‑nodD；五、以重组载体pET‑Plac‑nodD为模板进行PCR扩增，获得Plac‑nodD‑T7片段，然后将Plac‑nodD‑T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组原核生物表达载体pTR‑Plac‑nodD；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR‑Plac‑nodD转化到大豆土著根瘤菌中，即完成导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD‑SFH‑02的构建；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物为5’‑CGGCCATGGGTTTTAAGGG‑3’，下游引物为5’‑GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG‑3’；步骤三中PCR扩增所用上游引物为5’‑CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT‑3’，下游引物为5’‑GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG‑3’；步骤五中PCR扩增所用上游引物为5’‑CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG‑3’，下游引物为5’‑CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA‑3’。