[发明专利]一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法

摘要

一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法，它涉及一种定殖数量检测的方法。本发明解决了现有检测产甲酸草酸杆菌数量的方法存在的费时费力，结果误差较大、获得结果的周期长的问题。方法：一、确定检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组；二、实时PCR检测、三、根据公式进行计算即得到粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量。本发明的检测方法操作简单，误差小，便于推广，获得结果的周期短，与现有的方法相比较，时间缩短了80％以上，且本发明所得到结果准确，误差小。

主权项

一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法，其特征在于检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法按照以下步骤进行：一、提取待检测的粪便样品的基因组DNA，然后分别用第一亚组的引物和第二亚组的引物进行PCR扩增，电泳检测即确定出待检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组，其中，这两组PCR反应体系25μl均由0.2mMdNTP、0.5U Taq DNA聚合酶、100ng粪便样品的基因组DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR缓冲液和余量的去核酸酶的纯净水组成，第一亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亚组的下游引物为5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亚组的下游引物为5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；二、待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌为第一亚组，则以第一亚组代表菌HC-1作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA的质量；待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌的为第二亚组，则以第二亚组代表菌OxK作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA  的质量；以上实时PCR  的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，下游引物为5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；其中，实时PCR具体步骤为：将标准品的DNA稀释为0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六个不同浓度梯度，然后将待检测的粪便样品基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA加入到实时PCR反应体系中，实时PCR反应体系为25μL由1×QuantiTect SYBR Green PCRkit、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的样品和余量的去核酸酶的纯净水组成；三、将实时PCR测得的粪便样品DNA中的产甲酸草酸杆菌DNA的质量代入如下公式：产甲酸草酸杆菌的菌数＝产甲酸草酸杆菌的DNA的质量(ng)×4.82×105个菌数/ng，即得到了粪便中产甲酸草酸杆菌的定殖数量。