[发明专利]利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法

摘要

本发明提供一种基于工程菌株BL21-DE3发酵来获取5-羟基色氨酸的工艺。该工程菌株是利用已有报道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因构建重组表达载体，通过质粒转化得到工程菌株。利用该菌株进行一步发酵工艺优化，在不纯化色氨酸羟化酶的条件下，通过发酵成熟期添加底物色氨酸获得最终产物5-羟基色氨酸，且原料易得，成本低，转化率大于70％，收率大于80％。

主权项

一种利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于工艺步骤如下：A、工程菌株BL21-DE3的增菌发酵按大肠杆菌的常规发酵条件及方法，将初始菌种接种入种子罐，TSB为基础培养液，30℃下通气培养5小时后转入生产罐仍以TSB为基础培养液，调节PH值至7.0，30℃下通气培养12小时；B、发酵液中添加色氨酸底物后进行的次生代谢发酵在步骤A增菌发酵12小时之后，于发酵液中加入溶解在pH7.8磷酸缓冲液中的色氨酸溶液，使色氨酸最终浓度达到50％；，同时加入3～5g/L的吐温60阻滞菌体增殖，在发酵罐中通气1-2小时后停止转化，通气量1L/min，温度为35℃，并用HPLC检测反应进程；C、发酵液中色氨酸/5-羟基色氨酸含量的监控用反相色谱柱DIMONDC18(5μm，4.6X 250ram)，检测波长为280nm，流动相为甲醇∶水＝15∶85(v/v)，流速为1.0mL/分钟，进样量为20μl，灵敏度0.01AUFS，柱温为室温；以色谱峰面积积分值对浓度进行回归，得线性方程Y＝-258332+1.308413×106X(r＝0.9991)，RSD＝0.68％，5-羟基色氨酸含量在0.8-4g/ml范围内，含量与峰面积积分值呈良好的线性关系；D、发酵液5-羟基色氨酸的分离纯化发酵液停止转化后，离心收集上清液，调节pH值至5.9，收集沉淀，以30％碳酸钠溶液溶解，溶液以HPD-400大孔吸附树脂对5-羟基色氨酸富集，上柱条件：浓度为1.5mg/ml的5-羟基色氨酸，以500ml/分钟的速度通过HPD-400大孔吸附树脂柱，上样体积与湿树脂的质量之比为2∶1，40％乙醇以500mL/min的流速洗脱，洗脱液体积与湿树脂的质量之比为20∶1；洗脱液再经直接过聚酰胺树脂分离除去底物L-色氨酸，上柱条件：浓度为1.0mg/ml的5-羟基色氨酸，以200ml/分钟的速度通过聚酰胺柱，5-羟基色氨酸与聚酰胺树脂的重量比为0.25∶1，上样体积与湿树脂的质量之比为2∶1，20％乙醇以200mL/min的流速洗脱；洗脱液真空浓缩后，再将浓缩液的醇浓度调整到35％，在5～15℃的温度下1～3天结晶完全得5-羟基色氨酸产物。