[发明专利]同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法

摘要

同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法，它涉及4-羟基脯氨酸的合成方法。它解决了现有制备4-羟基脯氨酸的方法不适用于合成13C标记的4-羟基脯氨酸的问题。方法：一、对指孢囊菌中编码L-脯氨酸的4-羟基化酶的基因phy-1的原始序列进行密码子优化，获得优化的phy-1基因；二、优化的phy-1基因与pET19分别进行双酶切，构建原核表达载体，转入大肠杆菌中进行蛋白高效表达及纯化；三、纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶进行酶反应，纯化后即完成。本发明实现了13C标记的4-羟基脯氨酸的制备，纯化过程简单，成本低，并且所得13C标记的4-羟基脯氨酸的纯度达99.99％，回收产率为75.34％。

主权项

同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法，其特征在于同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法按以下步骤进行：一、对指孢囊菌中编码L-脯氨酸的4-羟基化酶的基因phy-1的原始序列进行密码子优化，获得优化的phy-1基因；二、优化的phy-1基因与经改造的原核表达载体pET19分别经NdeI和BamHI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建原核表达载体pET19-pp-histag-phy-1，然后RNA聚合酶插在DE3上的大肠杆菌C41中进行蛋白高效表达及纯化，获得纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶；三、纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶进行酶学合成反应，生成反应产物，然后进行纯化，获得13C标记的4-羟基脯氨酸，即完成同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成；其中步骤三中酶学合成反应的体系由480mM的MES缓冲液、24mM的13C标记的L-脯氨酸、48mM的2-酮戊二酸、12mM的硫酸亚铁、24mM的L-抗坏血酸和1.2mg/mL纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶组成；步骤三中酶学合成反应的温度为35℃，pH值为6.5。