[发明专利]一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法

摘要

一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，涉及分子生物学技术领域，本发明首先用EDTA缓冲液和PBS缓冲液预处理池塘底泥样品，然后进行底泥总DNA的粗提取，具体为：向底泥样品中加入适量石英砂、DNA提取缓冲液和蛋白酶K，37℃于摇床震荡20～30min，再加入SDS缓冲液混匀，65℃水浴60～90min，离心取上清；用等体积的氯仿-异戊醇抽提，离心，取水相；再用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提1～2次；加入冷乙醇和乙酸钠，-20℃放置2h，离心，收集DNA沉淀，经乙醇润洗后干燥，加入TE溶解，即得到池塘底泥总DNA的粗提液。本发明可用于PCR扩增、酶切和杂交等分子生物学操作。

主权项

一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，包含池塘底泥的预处理、总DNA的粗提取和DNA粗提液的纯化，其特征在于池塘底泥预处理按以下步骤进行：①称取采集的池塘底泥样品1～5g置于离心管中，8000rpm室温离心3min，弃上清；②向离心管中加入3倍体积20mmol/L EDTA缓冲液，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，并将此步骤重复一次；③向离心管中加入PBS缓冲液5～15mL与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，即样品预处理完毕；上述预处理后的样品用于后续分析；粗提取池塘底泥总DNA按以下步骤进行：①向预处理后的样品中加入0.8～3g酸洗石英砂，然后加入3～15mL的DNA提取缓冲液和10～50μL蛋白酶K 20mg/L，强力震荡5min混匀后，用摇床在37℃、225rpm条件下震荡20～30min；②向上述样品中加入500～2000μL SDS缓冲液，于65℃水浴60～90min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10min，并将上清转移到干净的离心管中；③向沉淀中加入1～5mL的DNA提取缓冲液和200～800μL SDS缓冲液，于65℃水浴10min，然后10000rpm室温离心10min，合并上清后，再重复一次；④收集的上清中加入等体积的氯仿‑异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清；⑤收集的上清中加入等体积的苯酚‑氯仿‑异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清，抽提1～2次；⑥收集的上清中加入1.5倍体积的冷乙醇和0.2倍体积的乙酸钠，漩涡震荡5min，‑20℃放置2h；⑦将步骤⑥处理后的样品于12000rpm室温离心10min，弃上清，并加入100～500μL 70％乙醇，摇匀后于40℃干燥；⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50～200μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液。