[发明专利]亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法

摘要

本发明涉及一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，通过提取A.catenella ACDH01的DNA，聚合酶链反应扩增A.catenella的18SrDNA到28S rDNA基因片段，并将扩增产物和T载体连接，构建重组质粒。经确认的重组质粒梯度稀释成聚合酶链式反应标准品；以5.8S-b5’和5.8S-b3’为引物，以重组质粒标准品为模板，real-time聚合酶链反应，根据反应中的临界循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值制备标准曲线。本发明建立了带有A.catenella的18S rDNA-28S rDNA基因片段的重组质粒real-time聚合酶链反应标准品，采用一对通用引物，可以准确、高效、快速地对待测的亚历山大藻进行real-time聚合酶链反应检测。

主权项

一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)对培养的亚历山大藻细胞计数，提取亚历山大藻A.catenella ACDH01的DNA，并测定DNA在260nm的吸光值；2)以提取的A.catenella ACDH01的DNA为模板，以18S rDNA序列5‘ CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG 3’和28S rDNA序列5‘ GGAGGGACCAGCTACTA 3’为引物，聚合酶链式反应扩增18S rDNA 28S rDNA区的片段；扩增的1600bp片段与pEASY Blunt Simple载体连接成重组质粒，将重组质粒转化宿主菌Trans1 T1，提取宿主菌Trans1 T1内重组质粒，经聚合酶链式反应鉴定及测序分析确认；3)检测经确认的重组质粒260nm吸光值，确定重组质粒的原液拷贝浓度，并将重组质粒原液稀释，得到梯度浓度为107 102copies/mL数量级的real time聚合酶链式反应重组质粒标准品；4)以重组质粒标准品为模板，以5.8S b5’：5‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3’和5.8S b3’：5‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3’为引物，进行real time聚合酶链式反应，根据反应中的临界循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值，制作real time聚合酶链式反应标准曲线。