[发明专利]一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法

摘要

一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法属于污染物健康损害能力检测方法领域，目前尚没有成熟的检测技术可以用于评价污染物致DNA去甲基化的能力强弱。本发明步骤：荧光质粒的人工甲基化处理；高甲基化荧光质粒转染Hela细胞制备重组细胞株；污染物样品前处理；5-甲基胞嘧啶标准系列与重组细胞株的共培养及受试样品与重组细胞株的同步共培养；重组细胞株的荧光摄片与荧光强度处理；污染物去甲基化能力检测标准曲线的绘制；受试样品污染物去甲基化能力的定量检测。受试细胞发出的绿色荧光会越亮，表示污染物去甲基化能力越强，导致人体产生健康损害的风险就越大。本发明创立一种快速、简易、可定量的检测方法，用于评价污染物致人DNA去甲基化能力。

主权项

一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法，其特征在于，步骤为：1)、荧光质粒的甲基化处理：购买绿色荧光质粒EGFP-C3，以下简称C3质粒，采用DNA甲基化酶Msss.I，对C3质粒进行人工甲基化处理，使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于70～95％的高甲基化状态；2)、高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株：将制备获得的高甲基化的C3质粒转染进入Hela细胞，制备Hela重组细胞株，然后将Hela重组细胞株传代于24孔板中；3)、污染物样品前处理：在各种污染物样品中加入硝酸，普通电热板上400℃消化1小时，待液体变澄清后烘干得到结晶，加入水将烧杯中结晶溶解备用；4)、5-甲基胞嘧啶与重组细胞株的同步共培养：以5-甲基胞嘧啶，以下简称5-AZA，配置标准系列，取10μl的5-AZA标准系列溶液分别加入到500μl的细胞培养液中，与Hela重组细胞株进行共培养18～36小时，使培养终浓度分别为0.0016μM，0.008μM，0.04μM，0.2μM；污染物样品与重组细胞株的同步共培养：取步骤3)中10μl的上述污染物结晶溶解液，加入到Hela重组细胞株培养液中，与5-AZA标准系列进行同步共培养18～36小时；5)、重组细胞株的荧光摄片与处理：对24孔板中的受试细胞株进行荧光摄片，每个细胞孔随机选取6-10个视野，每个视野摄片1次；对每个照片的荧光强度进行定量，获取每个受试细胞孔的荧光强度；6)、标准曲线的制备：将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其荧光强度进行回归拟合，制备标准曲线；横坐标为5-AZA的浓度，纵坐标为相应的荧光强度；7)、污染物去甲基化能力的定量检测：针对每个样品细胞孔中的摄片荧光强度具体数值，依据标准曲线得到相应的5-AZA的浓度当量；该当量表示其导致人DNA去甲基化的能力的具体强度。