[发明专利]金磁微粒标记免疫层析快速检测方法

摘要

本发明提供一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，旨在解决传统免疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁复、适用领域窄的问题。该检测方法的基本思想是：金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。本发明既可以通过金磁微粒的特征颜色进行可目视化的判读也可通过金磁微粒磁信号的强弱对被测物进行定量检测，方法简单，成本低，能够实现人体与动植物的疾病检测，环境的检测，食品安全检测、以及毒品和药物滥用检测等。

主权项

一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，包括以下步骤：1)金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗原按照与金磁微粒质量比10～500μg∶1mg加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～50℃、50～220rpm的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；所述偶联缓冲液为pH＝4‑9，0.005‑0.5M的磷酸盐缓冲液、pH＝3‑6，0.1‑3M的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液或pH＝6‑9，0.01‑3M的醋酸盐缓冲液中的一种，所述金磁微粒为核壳结构、组装结构、磁性氧化铁组装在核壳结构外层的金磁微粒或者基于以上三种结构进行表面功能化修饰的金磁微粒；1.2)于空气恒温振荡器中反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，得到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒；所述清洗缓冲液为下列任一溶液：pH＝4‑9，0.005‑0.5M，且含有0.5‑5％Tween20或者0.5‑5％Triton X‑100的磷酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.1‑3M且含有0.5‑5％Tween20或者0.5‑5％Triton X‑100的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液；pH＝3‑6，0.01‑3M且含有0.5‑5％Tween20或者0.5‑5％Triton X‑100的醋酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.1‑10M且含有0.5‑5％Tween20或者0.05‑2％Triton X‑100的硼酸盐缓冲液；pH＝2‑5，0.01‑1M且含有0.5‑5％Tween20或者0.5‑5％TritonX‑100的甘氨酸‑盐酸缓冲液；1.3)封闭：加入500ul～2ml的封闭剂到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒中，置于20～80℃、50～220rpm的恒温振荡器中充分混匀5min～12h进行封闭；所述封闭剂是采用上述偶联缓冲液溶解了以下物质的一种或多种：牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述组分的终浓度均为0.05％‑10％；1.4)将偶联抗体且封闭完毕的金磁微粒在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除未结合的生物分子，最后将此偶联有抗体且封闭完成的金磁微粒溶解在层析工作液中；所述层析工作液是缓冲液基液加上效应物，其中缓冲液基液为下列任一溶液：pH＝4‑9，0.005‑0.5M的磷酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.1‑3M三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液；pH＝3‑6，0.01‑3M醋酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.1‑10M的硼酸盐缓冲液；pH＝2‑5，0.01‑1M甘氨酸‑盐酸缓冲液；效应物是以下的一种或者几种：(1)柠檬酸，终浓度为0.1％‑5％，(2)三羟甲基氨基甲烷，终浓度为0.1％‑5％，(3)脱脂奶粉，终浓度为0.01％‑20％，(4)叠氮化钠，终浓度为0.01％‑5％，(5)分子量4000‑20000的聚乙二醇，终浓度为0.01％‑5％，(6)Tween20，终浓度为0.5‑5％；2)制作免疫层析检测条；该免疫层析检测条包括样品垫，结合垫，免疫层析膜，吸水纸和支撑板；2.1)免疫层析检测条的各部件的准备和处理所述样品垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；样品垫处理程序为：将样品垫浸泡于样品垫处理液中0.5分钟到2分钟后取出，或者按照0.5ul/20cm2‑20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均匀喷涂于样品垫上，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；所述样品垫处理液为缓冲液基液加上效应物；所述缓冲液基液为下列溶液中任一溶液：pH＝4‑9，0.005‑0.2M的磷酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.01‑3M三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液；pH＝3‑6，0.01‑3M醋酸盐缓冲液；pH＝6‑9，0.1‑10M的硼酸盐缓冲液；pH＝2‑5，0.01‑1M甘氨酸‑盐酸缓冲液；所述效应物是以下的一种或者几种：(1)分子量4000‑20000的聚乙二醇，终浓度为0.01％‑5％，(2)蔗糖或者海藻糖，终浓度为5％‑80％，(3)Triton X‑100，终浓度为：0.5‑5％；所述结合垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；结合垫处理程序为：首先将玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后将其浸泡于步骤1)所述的最初的层析工作液中0.5分钟到2分钟，或者采用非浸泡方式，而是按照0.5ul/20cm2‑20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均匀喷涂于裁剪成型的玻璃纤维或聚酯纤维裁上；然后15℃到60℃烘干或冷冻干燥；然后取经过步骤1.4)所得的含有偶联抗体或配体或抗原且封闭金磁微粒的层析工作液按照0.5ul/20cm2‑20ul/20cm2的比例喷涂于的结合垫上；最后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；所述免疫层析膜的材质为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；针对偶联抗体或配体或抗原选择的不同，免疫层析膜的处理程序分别为：若检测抗原，则金磁微粒偶联与检测抗原特异结合的抗体，首先取与待检目标物特异结合的另一抗体，按照0.1ul/20cm‑20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，取多克隆抗体按照0.1ul/20cm‑20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成与所述检测带平行的质检带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；若检查抗体，则金磁微粒偶联检测抗体特异结合的抗原，则首先取与待检目标物特异结合的另一抗原，按照0.1ul/20cm‑20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，取多克隆抗体按照0.1ul/20cm‑20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成与所述检测带平行的质检带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；若检测小分子受体，则金磁微粒偶联与待检目标物特异结合的配体，则首先取与待检目标物特异结合的另一配体，按照0.1ul/20cm‑20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；2.2)免疫层析检测条各部件组装成型，即：在带有不干胶的支撑板上依次贴上免疫层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层析膜的另一端接吸水垫，然后用不干胶彻底固定，最后裁切成免疫层析检测条；3)利用双抗夹心法或竞争法，对被测样品进行目视化判读或磁信号定量检测。