[发明专利]红豆杉细胞培养物及其大规模继代培养的方法

摘要

本发明提供了从红豆杉细胞中生产紫杉醇的工艺方法。采用光培养和暗培养相结合的方式，大规模生产红豆杉愈伤组织细胞。特征是，在B5改良培养基上对红豆杉进行愈伤诱导，诱导出不褐变可连续继代红豆杉细胞，光培养与暗培养相结合的方式对红豆杉细胞进行培养，获得紫杉醇含量为0.12％以上的高产细胞。通过对红豆杉细胞进行继代增殖，可大量生产红豆杉细胞。该细胞培养物可直接提取紫杉醇，解决了从植物树皮中生产紫杉醇工艺的资源匮乏、含量低、破坏生态环境等的缺点。与以有的细胞培养生产紫杉醇工艺相比，具有培养物中紫杉醇含量可稳步提高不退化，操作简便的特点。

主权项

一种红豆杉细胞组织培养物，其特征在于该培养物是经如下步骤得到的：I、植株诱导：将保藏的东北红豆杉种子用70～75％酒精浸泡25～30秒钟，再用0.1～0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4～6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下，去种皮，接种在配好的植株诱导B5培养基(B5基本培养基+赤霉素0.1mg/l 0.5mg/l+琼脂0.65％+蔗糖3％)上，每25ml培养基中接种4粒种子；在25℃，暗培养，10 15天，出芽后，培养成红豆杉植株；II、诱导愈伤组织：红豆杉植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的红豆杉植株作为外植体；将外植体接种于诱导愈伤组织B5培养基(B5基本培养基+2、4 D 0.5mg/L 2.0mg/L+6 BA 0.1mg/L 1.0mg/L)上，每25ml培养基中接种6～10块直径为0.5cm的外植体，暗培养35～40天，温度为22℃～28℃；诱导出红豆杉愈伤组织。III、培养物继代培养：筛选高产细胞系，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织的培养条件为：15重量份的愈伤组织种子需要在1000体积份的继代培养B5培养基(B5基本培养基+2、4 D 0.5mg/L 2.0mg/L+6 BA 0.1mg/L 1.0mg/L)培养，培养周期为35～40天，培养温度为20～30℃；至培养期，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织作为种子，种子量为生产量的15％。剩余75％生产量的培养物继代到改良B5培养基(B5基本培养基+2、4 D 0.5mg/L 2.0mg/L+6 BA 0.1mg/L 1.0mg/L)中，每25ml培养基中接种8块直径为0.8 1.0cm的细胞培养物，光培养，光照条件为3 6小时/天，白光，温度为22℃～28℃。培养30 35天后收集，低温真空干燥即为红豆杉细胞组织培养物。