[发明专利]一种生产重组蛋白A的方法

摘要

本发明涉及一种生产重组蛋白A的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了利用一种基因工程菌进行高密度发酵表达重组蛋白A的工艺条件，以及利用以IgG的Fc片段为亲和配基的亲和层析一步法高纯度分离纯化重组蛋白A的方法。应用以上方法生产重组蛋白A，高密度发酵的重组菌体培养密度达到OD600nm＝80-100，菌体干重40-50g/L，蛋白A表达量占菌体总蛋白的30-50％，每升菌液生产的蛋白A量最高达3g，SDS-PAGE及HPLC检测蛋白A纯度达95％以上。该方法具有生产量大，成本低，产品质量高等优点，为重组蛋白A的制备提供了一条切实可行的途径。

主权项

一种生产重组蛋白A的方法，包括表达蛋白A基因工程菌的高密度发酵及重组蛋白A的分离纯化方法；其特征在于如下步骤：第一步，基因工程菌的高密度发酵；本发明中所使用的基因工程菌，是将蛋白A完整的IgG结合功能区基因连接入pET表达载体中，再将上述重组质粒转入感受态E.coli BL21(DE3)中；采用补料分批发酵的培养方式，利用指数流加的补料方法实现表达重组蛋白A基因工程菌株的高密度发酵；发酵培养基中的碳源选用葡萄糖或甘油，诱导重组蛋白A表达的诱导剂选用IPTG或乳糖；第二步，重组蛋白A的分离纯化；利用以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A；(1)IgG的Fc片段的获取：采用木瓜蛋白酶酶解IgG，使其分解为Fc片段和Fab片段，通过以重组蛋白A为配基的亲和层析柱分离纯化Fc片段；(2)以IgG的Fc片段为配基的亲和层析填料的合成：采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向固定化；采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑活化，通过双功能团间隔臂分子将氧化后的Fc片段固定，合成了特异性结合重组蛋白A的亲和层析填料；(3)利用以上合成的亲和层析填料分离纯化重组蛋白A。