[发明专利]农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法，属于植物转基因技术领域。它包括愈伤组织诱导、预培养、含有目的基因农杆菌的活化与重悬、侵染和共培养、抗性愈伤组织筛选、丛生芽分化和生长、转化植株鉴定、转化植株培育和幼苗移栽等步骤，以及转化各过程中的专用培养基和诱导液的配方。本发明解决了大型丛生竹难于进行遗传转化的问题。可有效抑制农杆菌对植物外植体所造成的污染，缩短获得转基因植物的周期，提高获得转基因植物的几率。筛选一个月后即获得了抗性愈伤组织，二至四个月可获得再生的转基因植株。本发明转化效率高，重复性好，对大型丛生纸浆用竹遗传改良和竹功能基因组学研究等具有重要的作用及广阔的应用前景。适用于慈竹、梁山慈竹等大型丛生纸浆用竹的生产。

主权项

一种农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法，其特征在于，包括如下步骤：a.愈伤组织诱导：取竹种子成熟胚置于愈伤组织诱导培养基MS2上培养2 3周后，获得愈伤组织，3 4周后，获得竹胚性愈伤组织；b.预培养：将处于诱导后期的竹胚性愈伤组织转接至新鲜的愈伤组织诱导培养基MS2中预培养1周；c.含有目的基因农杆菌的活化与重悬：挑取含有目的质粒的农杆菌，在含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的农杆菌培养基YEB上划线，在28℃培养箱中培养两天；挑取单菌落于另一新鲜的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的农杆菌培养基YEB上继续培养两天；在超净台中刮取农杆菌培养基YEB平板上的农杆菌于诱导液中重悬混匀，使OD600接近0.2；d.侵染和共培养：取经过预培养的竹胚性愈伤组织于诱导液中振荡30min，取出竹胚性愈伤组织，在无菌滤纸上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培养培养基上共培养两天；e.筛选抗性愈伤组织：取出竹胚性愈伤组织转接至含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的抗性筛选培养基上筛选抗性愈伤组织；f.丛生芽分化和伸长：将筛选到的抗性愈伤组织转入丛生芽分化培养基，诱导丛生芽；g.伸长丛生芽根的诱导：取健壮丛生芽幼苗直接转入生根培养基生根；幼苗在生根培养基中生长15 20天，诱导生根，获得再生小植株；h.转化植株鉴定：用PCR方法对上述获得的再生小植株进行检测，确定外源基因已经整合到竹子基因组DNA中，确定转化小植株；i.幼苗移栽：将上述转化小植株洗净培养基，移入营养钵中，利用人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20 30天后，移栽入装有花园土、直径为30cm的花盆中。