[发明专利]同源四倍体天山雪莲植株的培育方法

摘要

本发明涉及一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法。该方法利用切除根、叶后的天山雪莲无菌苗的下胚轴茎段为外植体，通过含有不同浓度秋水仙素的固体培养基进行诱导处理，诱导产生四倍体天山雪莲植株，运用四倍体的筛选鉴定技术鉴定所得四倍体天山雪莲。该方法提供了诱导四倍体产生的最佳秋水仙素浓度、处理时间、处理温度以及用于四倍体鉴定的形态学、染色体计数和流式细胞仪的改进方法。通过此方法可快速实现同源四倍体天山雪莲植株的培育，缩短育种周期，进而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪莲在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题。

主权项

一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法，其特征在于按下列步骤进行：a、将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20‑50sec，然后用15％H2O2溶液消毒15‑50min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2‑5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10‑30粒种子，7‑15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；b、将步骤a中萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；c、将步骤b中下胚轴茎段接种于添加有2％二甲基亚砜和浓度为0‑0.20％秋水仙素的出芽诱导培养基上处理1‑3d，培养温度25‑30℃，光照强度50μmol·m‑2·s‑1，光照时间16h·d‑1，出芽诱导培养基为MS+BA0.3‑0.5mg/L+TDZ0.3‑0.5mg/L+NAA0.05‑0.1mg/L；d、将步骤c中处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基中培养25‑30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m‑2·s‑1，光照时间16h·d‑1；e、将步骤d中增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.05‑0.2mg/L生根培养基中生根；f、天山雪莲同源四倍体的筛选：将步骤e中的植株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定为同源四倍体植株；g、天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取步骤e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖组织，在温度0‑4℃，经过0.002mol/L 8‑羟基喹啉预处理或饱和对二氯苯水溶液预处理，卡诺固定液固定，温度60℃，1‑2mol/L盐酸解离6‑15min，改良苯酚品红染色液染色10‑15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，初步确定为同源四倍体植株；h、天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取步骤e中部分植株的叶片，于常温下在装有3‑5ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，500‑1000r·min～1离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定为同源四倍体植株；i、天山雪莲同源四倍体的移植：将步骤e中培育的植株洗去根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达82％。