[发明专利]用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法

摘要

用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法属细胞培养技术领域，本发明建立一种以微球作为细胞培养的载体、旋转瓶作为细胞增殖的发酵罐，体外大量扩增毛囊干细胞的方法，该方法操作简便，经济实用，避免反复传代细胞而导致的细胞增殖能力减弱、分化潜能降低等与传统扩增细胞方法相关的副作用，同时还节约培养液的用量；利用该方法扩增出来的毛囊干细胞增殖能力强，且仍保持原来的分化潜能，可用于：(1)建立毛囊干细胞银行，为成体干细胞相关研究提供优质的种子细胞；(2)移植修复病变的组织器官；(3)构建组织工程化器官，用作自体器官的替代物，用于移植修复病变或缺失的器官；(4)作为基因治疗的靶细胞，用于治疗相应的疾病。

主权项

一种用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法，其特征在于包括下列步骤：1)器具、材料的准备，包括：①细胞培养旋转瓶：垂直旋转瓶和水平旋转瓶，容量为10 10000ml，转速为1 500转/分；②微载体：其材料由一种或多种可生物降解材料构成，或由非生物降解材料构成，或由可生物降解与非生物降解材料构成；③细胞：包括哺乳动物毛囊干细胞和人毛囊干细胞；④培养液：包括DMEM、DMM F12、EGM、KGM、IMDM、MEM、EBM，其中添加一种或两种及以上生物因子；⑤细胞培养箱：CO2孵箱。2)毛囊干细胞的培养，包括：①将通过蛋白酶消化毛囊或毛囊组织块培养法而获得的人毛囊干细胞，以1X103 1X109细胞/克微载体的密度，接种在微载体上，悬浮于培养液中；②将微载体连同种植在其上的细胞一起，转移到细胞培养旋转瓶中；③依据细胞培养旋转瓶的容积，添加培养液至50 1000ml；④将细胞培养旋转瓶置于细胞培养箱内培养，细胞培养旋转瓶的转动模式设置为：转动1 5分钟/小时，转速10 300转/分钟。培养箱的设置为：37℃、5％CO2；⑤待细胞在微载体上贴附生长接近单层时，利用0.25胰蛋白酶 0.02％EDTA，将细胞从微载体上消化下来，经血清灭活胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液冲洗掉其中的血清和抗生素后，待用。