[发明专利]一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法

摘要

本发明涉及一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。本方法通过(1)悬浮胚性愈伤的培养；(2)菌株的活化及菌种的准备；(3)根癌农杆菌侵染；(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养，并采用GUS染色技术来鉴别转基因愈伤组织对外源基因的表达，在含有50μmol/L乙酰丁香酮的培养基上共培养的悬浮胚性愈伤组织经染色及脱色后在解剖镜下观察有大面积的细胞，呈蓝色，转化效率为80％左右。本发明操作比较简便，易于掌握，实施条件宽松，重复性高。

主权项

一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是：(1)悬浮胚性愈伤的培养选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120‑130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MS，添加外源激素为6‑BA、NAA和KT；6‑BA的浓度为0.1‑0.3mg/L，NAA的浓度为0.1‑0.2mg/L，KT的浓度为0.2‑0.3mg/L；液体培养基的PH为5.8‑6.0；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8‑12小时，再连续黑暗12‑16小时，温度为18‑20℃，每隔6到9天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1∶4，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)、50mg/L利福平(Rifampicin，RFP)的Yeast Extract Peptone(YEP)固体培养基上，28℃下培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含Kan，利福平的YEP液体培养基中，28℃，避光，200rpm振荡培养过夜；取培养过夜的根癌农杆菌菌液转接到含相同抗生素的液体YEP培养基中，继续避光培养3‑5小时，然后，以转速6000rpm离心8min，收集菌液于离心管中，用分子枪吸液体基本培养基MS吹悬根癌农杆菌菌体，加入乙酰丁香酮，调整OD600值为0.5‑0.7备用；(3)根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤(1)中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部后，将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤，然后将三角瓶放入转速为40‑50rpm的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均匀分布，温度为20℃，时间为20‑30min；(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织置于在无菌的滤纸上放干，保证菌液吸干，用无菌镊子接至含有乙酰丁香酮、PH为5.8～6.0的固体培养基MS上，20℃暗培养3天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。