[发明专利]可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法

摘要

本发明提出了一种可溶性截短的人TRAIL蛋白的制备方法，其步骤为：A)根据Genebank发表的人TRAIL蛋白可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计并合成寡聚DNA单链片段，B)三次PCR合成完整的双链DNA，C)利用T-载扩增，并将扩增的双链DNA片段插入表达载体并筛选阳性转化子，D)截短人TRAIL蛋白在大肠杆菌中低温表达，E)用三步法对该蛋白纯化，F)截短人TRAIL蛋白的测定。本发明实现了在大肠杆菌细胞内高效表达截短人TRAIL蛋白及其纯化制备技术，克服了现有技术中易形成不溶性包涵体的问题。该方法操作简单、发酵时间短、纯化容易并保证该蛋白无任何修饰，蛋白达到电泳纯。可以直接用于生化、分子生物学、肿瘤学的研究工作以及肿瘤治疗的临床前期或临床药物的开发。

主权项

一种可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA；根据Genebank发表的人TRAIL蛋白可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计24种寡聚DNA单链片段，人工合成全部DNA单链片段；B、三轮PCR合成完整的双链DNA片段；将24种DNA单链片段分成2‑3组，每组50μl的体系中分别加入浓度为10μM的每种寡聚DNA单链片段1.5μl、10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH2O至50μl，进行第一轮PCR，共扩增20个循环，回收PCR产物；每组取2μl第一轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.2μl，并补加ddH2O至50μl进行第二轮PCR，共扩增30个循环，回收PCR产物；每组取2.5μl第二轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、带限制性内切酶位点的5’‑和3’‑端引物各1.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH2O至50μl进行第三轮PCR，共扩增20个循环，回收PCR产物，得到全长完整的双链DNA片段；C、利用T‑载扩增，将全长DNA片段克隆并转化：将0.5μl回收的第三轮PCR产物与2μl T‑载连接缓冲液、0.2μl pMD18‑T载体DNA混合，加ddH2O至5μl，混匀后16℃保温4小时，取3μl连接反应液，按常规CaCl2法转化E.coliTop10，用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板37℃培养12小时筛选阳性菌落，将单个阳性菌落送商业公司检测插入的DNA序列正确性；D、在大肠杆菌中高效低温表达截短的人TRAIL蛋白(1)将测序正确的阳性菌落接种至5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12小时，并用质粒DNA抽提试剂盒抽提T‑载重组质粒DNA，分别将20μl T‑载重组质粒和pET23a表达载体DNA与5μl 10×H缓冲液、2μlNdeI、2μlXhoI和21μl ddH2O混合，37℃酶切反应4小时，用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段，然后在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pET23a质粒DNA和编码截短人TRAIL蛋白的DNA片段，再加入1μlT4DNA连接酶，16℃水浴4‑12小时形成重组表达质粒；(2)利用常规的CaCl2法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，然后将5‑10μl上述连接反应混合物与100μl感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟，加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；(3)将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的摇瓶中17℃摇动培养，摇床转速为250rpm，当OD600值达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导8‑20小时，细胞经4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有1mM DTT和5％甘油的50mM TrisHCl缓冲液中(pH7.4)，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液；E、截短人TRAIL蛋白的三步法纯化在50ml上清粗酶液中加入硫酸铵至终浓度40％，4℃放置2小时，12,000rpm离心15分钟，去除沉淀，在离心后的上清液中加入硫酸铵至终浓度60％，4℃放置4‑12小时，12,000rpm离心15分钟，移去上清液，用20ml 50mM TrisHCl(pH7.5)悬浮沉淀物，并用50mM TrisHCl(pH7.5)4℃透析除去硫酸铵；然后将样品上样至50mM TrisHCl(pH7.5)平衡的CM‑Sepharouse阳离子层析柱并用0‑0.8M NaCl进行梯度洗脱，流速为2ml/min，自动收集洗脱流出液，蛋白经10％SDS‑PAGE电泳鉴定；在含有截短人TRAIL蛋白的蛋白溶液中加入40％硫酸铵后，直接上样Butyl‑Sepharose层析柱(平衡用缓冲液为40％(NH4)2SO4‑50mM TrisHCl(pH7.5))，用40％‑0硫酸铵进行梯度洗脱，流速为2ml/min，自动收集洗脱流出液，10％SDS‑PAGE电泳鉴定蛋白纯度。