[发明专利]禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法

摘要

本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵产生中等抗性水平菌株的分子检测方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性监测和流行预警。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取待测菌株的核基因组DNA；(2)运用内外引物对进行巢式PCR反应，获得目标片段；(3)将目标片段用限制性内切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分别酶切，从酶切产物电泳图谱可以准确鉴定中等抗性菌株基因型。采用PIRA-PCR(Primer-introduced restriction analysis PCR)技术可以快速、准确地检测出田间中等抗药性禾谷镰孢菌的数量及其在群体中的比例。检测准确率达95％以上。

主权项

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法，其特征在于采用PIRA‑PCR(Primer‑introduced restriction analysis PCR)技术检测禾谷镰孢菌群体中存在的对苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)的中等抗性菌株，并以此计算抗性比例。一种禾谷镰孢菌对多菌灵产生中等抗性水平菌株的分子检测方法，共分三步：第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。第二步：运用内外引物对，进行巢式PCR反应，获得164bp的目标片段。巢式PCR反应体系及其扩增程序：(1)外引物扩增：反应体系：PCR buffer(10×)     2.5μLdNTP(2.5mM each)     2μLMgCl2(25mM)          1.5μLNoF(10μM)           0.5μLNoR(10μM)           0.5μLdH2O(灭菌蒸馏水)     16.8μLTaq(5U/μL)          0.2μLDNA模板              1.0μL                        总体积               25μL扩增条件：预变性：94℃         5min            ↓变性：94℃           15s退火：58℃           30s延伸：72℃           30s35个循环            ↓延伸：72℃           5min(2)内引物扩增：反应体系：PCR buffer(10×)     2.5μLdNTP(2.5mM each)          2μLMgCl2(25mM)               1.5μLNoF(10μM)                0.5μLNoR(10μM)                0.5μLdH2O(灭菌蒸馏水)          16.8μLTaq(5U/μL)               0.2μLDNA模板*                  1.0μL                                   总体积                    25μL*DNA模版为外引物扩增产物稀释50～100倍量浓度扩增条件：预变性：94℃              5min              ↓变性：94℃                15s退火：56℃                30s延伸：72℃                30s35个循环              ↓延伸：72℃                5min第三步：将巢式PCR获得的目的条带(164bp)限制性内切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分别酶切，从酶切产物电泳图谱(3％琼脂糖凝胶)可以准确鉴定中等抗性菌株基因型，并以此判断菌株抗性水平。(1)HindIII酶切体系：10×Buffer R              2μLHindIII(10unit/μL)       1μLPCR产物                   8μLdH2O(灭菌蒸馏水)          9μL                                 总体积                    20μL37℃孵育1～3小时完全酶切(2)TaaI酶切体系：10×Buffer Tango          2μLTaaI(10unit/μL)          1μLPCR产物                   8μLdH2O(灭菌蒸馏水)          9μL                             总体积                    20μL65℃孵育1～3小时完全酶切。