[发明专利]桔黄假单胞菌的培育方法及应用

摘要

本发明属于生物技术，一种桔黄假单胞菌的培育方法及应用。现有技术发现桔黄假单胞菌对多种植物致病菌有抑制作用，但是桔黄假单胞菌在自然界中存在数量少，繁殖速度慢，无法满足植物防治病害、促进植物生长的需要。本发明桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：试样采集；制备培养基；选择和确定抗生素和供试病原真菌；菌种初筛和复筛；将复筛选出的菌种发酵繁殖。将桔黄假单胞菌在防治油菜、水稻、小麦、蕃茄、玉米病害中应用。本发明的优点是：具有高效抑菌活性，防治植物病害效果显著；人畜安全、无毒；促进农作物生长；繁殖容易；使用简便。

主权项

一种桔黄假单胞菌的培育方法，步骤如下：(1)试样采集：从上海市嘉定区红薯作物的根际土壤，深度5cm‑15cm，采集土样，风干，贮存于塑料袋中，置于冰箱4℃保存备用；(2)制备培养基：①KB液体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O 1.5g、去离子水1L，混合静置；②固体富集培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O1.5g、去离子水1L、琼脂18g，混合静置；③斜面保藏培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母膏5g、琼脂18g、去离子水1L，混合静置；④真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、去离子水水1L，混合静置；⑤固体真菌培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂38g、去离子水水1L，混合静置；(3)抗生素和供试病原真菌：①抗生素：氨苄青霉素贮存浓度50mg/mL，氯霉素贮存浓度34mg/mL；②供试病原真菌：油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、玉米小斑病菌Bipolaris maydis；(4)菌种筛选：①菌株分离、纯化与保存：将采集试样放入含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的1/3KB液体富集培养基培养6‑8小时；将富集好的菌液在含有氨苄青霉素40μg/mL与氯霉素13μg/mL的KB固体培养基上，梯度稀释、平板涂布；将涂布好的KB平板置于28℃培养箱中培养2‑3天，挑取单菌落接至新鲜固体培养基上，分离纯化4‑6代后保藏于斜面培养基，备用；②供试菌株平板对峙生长法初筛：以油菜菌核病菌为指示菌，将分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选；在内径90mm的PDA平板中央接种直径为8mm的油菜菌核病菌菌饼；同时在距菌饼相距25mm的4个角处分别点接4个分离纯化后待测的细菌菌株；对照平板接种病原真菌菌饼，重复试验3次；将做好的平板置于25℃培养，3‑5d内观察待测菌株对油菜菌核病菌的拮抗作用，选择对病原真菌有抑制作用的菌株进行复筛；③拮抗菌株的复筛：在病原真菌菌饼两侧距离30mm的位置点接同一个菌株，选取拮抗菌株菌落边缘到病原真菌菌落边缘距离大、抑菌宽带、拮抗作用持久的菌株，备用；(5)将上述复筛选出的菌种发酵繁殖，方法为：①制备培养基：蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L；②培养基起始pH7.0；③将菌种接种到培养基，接种量3％；④培养基温度25℃；⑤摇瓶转速200r/min，培养时间60h。