[发明专利]一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法

摘要

本发明公开了一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，涉及治疗血栓病的纳豆激酶的分离提取技术领域，解决了目前纳豆激酶纯化工艺复杂，不适合工业化生产的问题。采用乙醇沉淀粗提、阴阳离子交换树脂层析和HPD-400大孔吸附树脂精制来分离纯化得到纳豆激酶纯品，本发明采用适于工业化生产的柱层析填充材料，代替了常用的昂贵的凝胶等材料，收率可达59％，纯度95％以上，具有收率高、成本低、可以进行规模化生产的特点，基本解决了工业化生产中纳豆激酶分离纯化的瓶颈问题，为高效率分离得到高纯度、高酶活的纳豆激酶创造了条件，具有良好的经济效益和社会效益。

主权项

一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，包括以下步骤：(1)发酵液的预处理：发酵所得约10L发酵液放罐后立即进行板框过滤或离心去杂，滤液转移至沉淀罐。将研细的(NH4)2SO4按照20％饱和度加入到沉淀罐中，4℃下保存过夜，弃去沉淀(沉淀为初步分离的杂蛋白)，收集上清液备用。将上清液移至另一沉淀罐，加入乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀，用10mmol/L pH9.0的磷酸缓冲液溶解残渣，定容到1L，测定各项指标。(2)阴离子交换树脂去杂：用Styrene‑DVB大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂)去除杂质和色素。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 9.0的磷酸缓冲液平衡、上样、收集滤过液、浓缩。(3)阳离子交换介质分离：选择Styrene‑DVB大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂做为离子交换的介质。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡、上样、磷酸缓冲液洗柱、含1.0mol/L NaCI的磷酸盐缓冲液洗脱、分部收集、测定各部分活性和纯度、收集合并活性部分、浓缩。(4)大孔吸附树脂层析纯化：采用HPD‑400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)进一步纯化以得到95％以上的纯品。其操作步骤为：装柱、平衡、上样、40％乙醇洗脱；分部收集，测定酶活和纳豆激酶含量，合并高酶活和高含量的洗脱液。(5)冷冻干燥：采用薄膜浓缩法对洗脱液进行除菌和浓缩，冷冻干燥，得到纳豆激酶纯品。