[发明专利]一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种超声辅助农杆菌介导的植物inplanta遗传转化方法，步骤是：A、农杆菌培养及转化前处理；B、超声辅助农杆菌介导的遗传转化：选择植株，去除开放的花朵，将植株的花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行不同时间倒置超声侵染处理，标明处理时间，侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，于土壤钵中置培养，待成熟期收获种子；C、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选；D、PCR检测抗性植株中的基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测。方法易行，操作简便，成本低，可2人1天内同时对1500-2000株植株进行转化，加强了菌液的渗透率，显著提高了遗传转化效率。

主权项

一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其步骤是：A、农杆菌培养及转化前处理 ：将农杆菌菌株接种于LB培养基，28℃，摇床培养1～2d后，再转接新鲜的LB培养液中，摇菌22‑26 h，使OD600在1.8～2.0，6000rpm 离心收集菌体10～15 min，室温为20‑25℃，2倍体积转化培养基溶解；B、超声辅助农杆菌介导的in planta遗传转化：选择待处理的植株，去除所有已开放的花朵，将所有植株的主花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行2～30 sec不同时间倒置超声侵染处理，同时挂牌标明处理时间，侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放22‑26h后，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，于土壤钵中置正常生长条件下培养，待成熟期收获T1代种子；所述的待处理植株为刚开放1‑2朵花花蕾期的植株；所述的超声辅助农杆菌介导的植物in planta高效遗传转化的对象为未开花的花蕾；所述的超声波处理的参数为：电源220V 50Hz超声频率为28/45 KHz，超声电功率为500W；所述的超声处理时间为2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4个处理，分别以未经超声直接侵染处理的植株为各自对照：2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；C、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选，所述的卡那霉素抗性筛选浓度为350 mg/L；D、PCR检测抗性植株中的gus基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测，所述的PCR检测抗性植株中的gus基因所用到的引物是：GusF2：CGGCAAAGTGTGGGTCAAT   5’to 3’GusR2：AAGGGTAATGCGAGGTACGGT  5’to 3’ Gus基因扩增片段长度为500bp。