[发明专利]一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法

摘要

本发明公开了一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，提供一种快速、准确的水稻品种的ISSR指纹图谱构建方法及其应用。该方法包括以下步骤：用改进的CTAB法提取水稻幼苗DNA；以幼苗DNA为模板进行ISSR-PCR扩增；对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外光下拍照；构建水稻品种的DNA指纹图谱，用于水稻品种真实性鉴定。本发明DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型、每条谱带的位点编号及“0”“1”阵列为基本信息，该方法具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISSR分子标记技术在准确、快速、简便的水稻品种真实性鉴定中更广泛地应用。

主权项

一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，该方法包括DNA提取、ISSR‑PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。具体包括以下步骤：(1)DNA提取以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于‑20℃保存备用；(2)ISSR‑PCR扩增及电泳检测采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50‑56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel‑Red染色，检测ISSR‑PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；(3)DNA指纹图谱构建根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。