[发明专利]一种猪细菌的多重PCR检测方法

摘要

本发明提供一种猪细菌的多重PCR检测方法，先提取被检标本DNA，应用PCR检测试剂盒进行PCR扩增，对扩增产物分析，检测出被检标本中的猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌。本发明同时对猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断，方法快速、准确。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。本发明也可用于猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌病的分子流行病学调查及疗效监测。

主权项

一种猪细菌的多重PCR检测方法，通过以下技术方案实现：(1)被检标本DNA提取：取病变组织匀浆后37℃培养，再经蛋白酶K温浴消化，取消化后的培养物离心、收集沉淀，用ddH2O重悬后再离心一次，弃上清，沉淀用等体积的2×TZ和ddH2O重悬，‑20℃静置，经沸水浴后立即置冰浴中冷却，4℃下离心，取上清使用或者‑20℃冻存备用；(2)设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液组成；(3)PCR扩增：在PCR试剂管中加入Taq DNA聚合酶及处理后的标本DNA，同时设阴性、阳性对照，微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件为95℃预变性4min，94℃变性1min，60.5℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸8min，保存于4℃；(4)扩增产物分析：将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检标本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的阳性或阴性。