[发明专利]一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法

摘要

本发明涉及一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法。本发明解决传统的蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、灵敏度低以及现有的基因检测技术必须进行预增菌，无法快速检测原料乳中蜡样芽孢杆菌并且易污染的问题。检测方法：一、对待检测的原料乳进行脱脂处理；二、加入EDTA-Na溶液进行水浴；三、过滤水浴后的脱脂乳；四、收集洗脱液；五、提取菌体DNA，并进行Real Time RT-PCR检测。本发明操作简单；不需要预增菌，具有快速的优点；本发明能够快速过滤原料乳中的菌体；本发明对蜡样芽孢杆菌的致病基因进行了引物设计，针对性强、特异性好。

主权项

一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法按以下步骤实现：一、将待检测的原料乳离心进行脱脂；二、将脱脂乳与EDTA‑Na溶液以5‑7∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA‑Na溶液，在37℃的温度下水浴20‑30min；三、将水浴后的样品进行无菌过滤；四、用生理盐水洗脱滤膜上的菌体，离心2次后弃掉上清，收集菌体；五、利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA作为模板，进行Real TimeRT‑PCR检测，根据扩增曲线和融解曲线进行分析；即得到检测结果；其中步骤五中20ul反应体系由10ul的2×SYBR buffer、2.0ul的DNA模板、1.0ul的引物和7.0ul的灭菌双蒸水组成；扩增反应条件为预变性95℃30s，变性95℃5s，退火60℃35s，共40个循环；蜡样芽孢杆菌上游引物为5’‑AGTTCGTAGCCTATGCCGT‑3’，下游引物为5’‑GGCTTATTCGCTATGCG‑3’。