[发明专利]一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法

摘要

目前对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。本发明公开了一种通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针；四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。

主权项

一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：所述的扩增引物序列为：HEV‑F    TATTCATCCAACCAACCCCTT，HEV‑R    GTCDCGCCAAGYGGAGC，该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C；所述的TaqMan探针序列为：I‑P     CY5‑TGTCACCGCTGCGGCCG‑BHQ3，II‑P    ROX‑AGACGTTGCCGCTGCGTCC‑BHQ2，III‑P   HEX‑TTTCACAAYCCGGGGCTGGA‑BHQ 1，IV‑P    FAM‑CGCATCTGACATWCCARCCGC‑BHQ 1，四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列中Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G；PCR鉴别检测方法的步骤如下：1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μLDEPC水溶解；2)在PCR反应管中配置反应体系，体系的总体积为25μl，其组成如下：10μl荧光定量PCR Mix，1.2μl浓度为10μM的HEV‑F，1.2μl浓度为10μM的HEV‑R，0.5μl浓度为10μM的I‑P，0.5μl浓度为10μM的II‑P，0.5μl浓度为10μM的III‑P，0.5μl浓度为10μM的IV‑P，8μl HEV阳性RNA模板，双蒸水补至25μl；3)将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：42℃，30min；第二阶段：95℃，3min；第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环，并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号；4)阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做；检测样品CT值≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品35.0＜CT值＜40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，报告样品阳性，否则报告样品阴性；检测样品CT值为零，报告样品阴性。