[发明专利]一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法

摘要

本发明公开了一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，以SEQIDNO.1所述的核苷酸序列为抗玉米粗缩病的目的基因序列，通过四次PCR反应，获得目的基因序列，经限制性内切酶酶切、分离、回收、连接，构建植物表达载体；将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。该方法利用RNA干扰技术，可培育出优良的抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。

主权项

一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK‑int，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK‑int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK‑int‑FR303；用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK‑int‑FR303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19‑MRDV303；将植物表达载体pJIM19‑MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。