[发明专利]利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法

摘要

本发明公开了一种利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法。该方法以离体器官为原始材料，诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织，愈伤组织继代培养后，经过筛选高产悬浮单细胞系，分离咖啡豆细胞，获得2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸。诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织是经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25～30℃，pH值5-6，暗或弱光培养3-6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸对蔗糖及其它甜味剂均有甜味抑制的作用。

主权项

一种利用细胞工程法生产2‑(4‑甲氧基苯氧基)‑丙酸的工业化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25～30℃，pH值5‑6，暗或弱光培养3‑6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：10～15mmol/L泛酸钙、0.5～0.6mmol/L肌醇、8.0～8.5μmol/L烟酸、3.0μmol/L盐酸硫胺素、5.0μmol/L盐酸吡哆醇和0.04mmol/L生物素；所述生长素添加量为1～12μmol/L，采用2，4‑二氯苯氧乙酸、萘乙酸或吲哚乙酸；所述细胞分裂素添加量为0.4～0.5μmol/L，采用6‑呋喃甲基腺嘌呤、6‑苄基腺嘌呤和玉米素中的一种；(2)愈伤组织的继代培养；优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织进行继代培养，继代培养所用培养基同步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基，培养温度25～30℃，暗培或间歇光照培养2～3周，更换新鲜培养基1～3次；(3)筛选高产悬浮单细胞系；优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含液体培养基中，转速为100‑120r/min，温度为25‑30℃条件下，暗培养6‑10天，培养出悬浮单细胞系，将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，25～30℃，暗培养18‑22天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；所述液体培养基是在步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2～0.8mg/L 2，4‑二氯苯氧乙酸和0.05～0.2mg/L 6‑呋喃甲基腺嘌呤；所述平板固体培养基的组成与步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基相同；(4)高产悬浮细胞系的悬浮培养；将筛选出的高产悬浮细胞系按照300～1000mg/100mL的密度接种于悬浮细胞培养基中，培养条件为25～30℃，摇床120±5r/min，黑暗培养12‑14d；所述悬浮细胞培养基是在步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2～0.8mg/L 2，4‑二氯苯氧乙酸和0.05～0.2mg/L 6‑呋喃甲基腺嘌呤；收获咖啡豆细胞；(5)分离咖啡豆细胞，获得2‑(4‑甲氧基苯氧基)‑丙酸。