[发明专利]一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针

摘要

本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体公开了一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针。本发明对腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒（HKU1、NL63和SARS）、副流感病毒（I型、II型、III型和IV型）共14种呼吸道病毒核酸序列进行分析，设计相应的反转录引物、PCR引物和特异性探针；以反转录和多重不对称PCR的方法扩增特定基因片段；采用液相芯片技术将偶联有病毒特异性探针的荧光编码微球组与PCR扩增产物温育杂交，最后用Bio-PlexTM200进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，且操作简单，检测速度快。

主权项

一种检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，具体步骤为：（1）利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)的核酸序列进行病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对相应基因片段的反转录引物、PCR引物和特异性核酸探针；其中人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4) RNA病毒设计反转录引物，腺病毒(AdV)和博卡病毒(BOV)这两种DNA病毒不设计反转录引物；（2）采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；（3）采用多重不对称PCR的方法分两组对病毒cDNA/DNA进行PCR扩增，其中每对引物中有一个5’端修饰有生物素标记，以使该条单链产物能与偶联于微球上特异性核酸探针互补结合并利于后期信号标记；（4）特异性核酸探针5’端进行C12‑胺基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性核酸探针的混合微球组温育杂交，最后用Bio‑PlexTM 200进行检测。