[发明专利]奶牛大肠杆菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种奶牛大肠杆菌乳腺炎灭活疫苗及其制备方法，疫苗是临床分离野毒株经基因定点缺失LPS编码基因galE以暴露其核心抗原，而不影响除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，筛选出大肠杆菌重组工程菌株乳房炎灭活疫苗，具有代表大肠杆菌感染所致奶牛乳房炎优势疫苗菌株，进一步通过发酵规模化生产菌液、灭活、纯化等工艺，经此形成灭活全菌抗原，加入或不加入SP01、SP02、白花油、FIA、铝盐、MF59、免疫刺激复合物、脂质体、免疫细胞因子等佐剂，该方法制备的疫苗剂型，通过皮下、肌肉、奶头乳管注射、微针透皮等免疫接种奶牛后，可有效预防大肠杆菌感染性奶牛乳房炎的发生。

主权项

奶牛大肠杆菌乳腺炎灭活疫苗的制备方法，其特征是：(1)、通过对奶牛乳腺炎奶汁样品分离、鉴定出的奶牛乳房炎大肠杆菌株，确定了我国大肠杆菌奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株，包括任何适宜于制备奶牛乳房炎大肠杆疫苗生产的当前和今后广泛流行大肠杆菌野生株；(2)、通过构建自杀致死质粒pCVD442‑galE，运用同源重组技术敲除大肠杆菌候选优势菌株的LPS编码基因galE以暴露其核心抗原，而不影响除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，筛选出大肠杆菌重组工程菌株，包括通过该方法制备的其它突变菌疫苗株，在体外普通培养基中生长良好，传代稳定、免疫原性良好的奶牛大肠杆菌乳房炎优势疫苗菌株；(3)、选用奶牛大肠杆菌乳房炎优势疫苗菌株，制备优势流行菌株的兔血清，与已有国内外临床分离奶牛大肠杆菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和达97％以上，由此选用的奶牛乳房炎大肠杆菌优势疫苗株具有代表国内外流行株；(4)、选用奶牛大肠杆菌乳房炎优势疫苗菌株，建立奶牛大肠杆菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批、工作种子批库，菌种分装保存；进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的大肠杆菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产用要求；(5)、通过奶牛大肠杆菌苗工作种子批库，进行放大培养，制备奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗原液，经灭活、离心分离、生化提取制备了纯化大肠杆菌灭活全菌，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌抗原原液；进一步进行血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定；(6)、用纯化灭活全菌抗原原液，制备有或无佐剂的奶牛大肠杆菌灭活疫苗注射剂型，可用于不同品种、不同年龄奶牛通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮等免疫接种，也可以一种或几种联合免疫；奶牛大肠杆菌乳房 炎灭活疫苗制品放置2～8℃保存。