[发明专利]一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法

摘要

本发明公开了一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法，包括聚乙二醇-叶酸缩合物的合成，壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸的合成，腺病毒-壳聚糖纳米复合物的制备等步骤，制得腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，通过对腺病毒进行化学修饰来减少其对肝脏的毒性，降低抗体对其的抵制；通过在腺病毒表面的离子交联壳聚糖或其与聚乙二醇以及叶酸的缩合物，提供了化学交联位点以及实现靶向的物质，维持了腺病毒的原始生物活性的同时，也延长了其在体内循环的时间，且不降低其生物活性和传染性，进一步地，还可提高靶向部位的局部浓度，治疗效果好且可实现大规模加工生产。

主权项

一种腺病毒‑壳聚糖纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)聚乙二醇‑叶酸缩合物的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺、N‑羟基丁二酰亚胺按照1∶1∶1～1∶5∶5的摩尔比溶于二甲基亚砜，在氮气保护下活化6～48小时，过滤后得到活化的叶酸溶液，然后按照叶酸与聚乙二醇的摩尔比为20∶1～1∶2的比例加入重均分子量为2000～10000的聚乙二醇，在氮气保护下反应1～24小时，加入丙酮沉淀后离心除去多余叶酸，上清液用去离子水透析后冻干即得到聚乙二醇‑叶酸缩合物；(2)壳聚糖‑聚乙二醇缩合物、壳聚糖‑叶酸缩合物以及壳聚糖‑聚乙二醇‑叶酸的合成：将低分子量的壳聚糖溶于蒸馏水，配制成质量百分浓度为0.1％～10％的壳聚糖溶液，搅拌过夜；然后在常温下分别按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇、二氯乙烷以及N‑羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入叶酸、二氯乙烷以及N‑羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇‑叶酸缩合物、二氯乙烷以及N‑羟基丁二酰亚胺，搅拌过夜，反应液分别用去离子水透析，冻干后得到壳聚糖‑聚乙二醇缩合物、壳聚糖‑叶酸缩合物以及壳聚糖‑聚乙二醇‑叶酸缩合物，其中，壳聚糖与聚乙二醇的摩尔比为1∶5～5∶1，壳聚糖与叶酸的摩尔比为1∶5～5∶1；(3)腺病毒‑壳聚糖纳米复合物的制备：将低分子量壳聚糖、壳聚糖‑聚乙二醇缩合物、壳聚糖‑叶酸缩合物以及壳聚糖‑聚乙二醇‑叶酸缩合物分别在常温下溶解于磷酸盐缓冲液中，制成质量百分浓度为1％的溶液；将所述溶液分别与60μl浓度为1×1012VP/ml的腺病毒混悬液混合，得到腺病毒/壳聚糖混合液、腺病毒/壳聚糖‑聚乙二醇混合液、腺病毒/壳聚糖‑叶酸混合液、腺病毒/壳聚糖‑聚乙二醇‑叶酸混合液，将上述混合液按照体积比为1∶1∶1∶1～2∶3∶2∶3的比例再次全部混合后进行静电纺丝，其中，所述静电纺丝的参数如下：电压为10～20KV、溶液流速为2～10mL/h、针尖到磷酸三甲苯脂接收池的接收距离为5～15cm，接收后缓慢搅动10～30min，再进行离心浓缩除去未反应的物质，得到腺病毒‑壳聚糖纳米复合材料，于4℃下储存。