[发明专利]一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法

摘要

本发明提供一种操作简单、快速、有效的重组人血清白蛋白的纯化方法，重组人血清白蛋白溶液经过亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取、回收有机溶剂、加热除色素、结合方式的疏水层析和硼酸盐处理等步骤纯化后，可以得到电泳纯度大于99.9％，多糖含量不高于1.89μg/ml，色素比值A350/A280低的重组人血清白蛋白，同时经亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取的重组人血清白蛋白溶液具有不易降解、稳定性高的特点。本发明解决了人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量低的问题，具有很好的应用前景。

主权项

一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)双水相萃取：向获得的重组人血清白蛋白溶液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节可溶性无机盐、亲水性有机溶剂和含重组人血清白蛋白溶液比例形成双水相，上相即为富含重组人血清白蛋白的萃取相；加入的可溶性无机盐占双水相体系的质量百分数为5％～35％；加入亲水性有机溶剂占双水相体系的质量百分数为5％～40％；可溶性无机盐为磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卤化物或其中二种以上的混合物；亲水性有机溶剂为碳数不高于8的醇类、碳数不高于8的酮类或其二种以上的混合物；(2)回收有机溶剂：对双水相萃余相采用蒸馏和/或精馏的方法回收有机溶剂，蒸馏前需用酸或碱调节pH为5.5～9.0，蒸馏和/或精馏处理的温度为20～45℃，时间为15～60min，蒸馏和/或精馏时重组人血清白蛋白溶液中添加终浓度为5～20mmol/L的辛酸钠、1～10mmol/L的半胱氨酸和1～10mmol/L的EDTA；回收有机溶剂后，重组人血清白蛋白溶液中有机溶剂含量低于20％；(3)加热除色素：将回收有机溶剂后的重组人血清白蛋白溶液加热处理，加热温度为60～80℃，加热时间为30min至5h，pH为5.0～8.0；(4)疏水层析：加热处理后的重组人血清白蛋白溶液超滤、加无机盐并调节pH值后，使之流入装有疏水介质的色谱柱；使用含5～20mmol/L辛酸钠的无机盐溶液洗脱，得到纯化的重组人血清白蛋白；上样液pH为5.5～9.0，无机盐溶液浓度为0.6～4.0mol/L，洗脱液pH为5.5～9.0，无机盐溶液浓度为0.01～0.5mol/L；疏水层析介质的配基含有苯基、丁基或辛基基团；纯化的重组人血清白蛋白只能从与疏水介质结合部分得到；(5)硼酸盐处理：在经疏水层析纯化的重组人血清白蛋白溶液中加入四硼酸钠和氯化钙、调节pH值、并搅拌，离心或过滤去除沉淀，从上清液中回收重组人血清白蛋白：四硼酸钠的浓度为0.01～1.0mol/L，氯化钙的浓度为0.01～1.0mol/L，pH为pH 8.0～11.0，搅拌时间为15min～10h。