[发明专利]一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用

摘要

一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明将从肠杆菌9043C12中分离纯化的酸性脲酶，溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得到固定化酸性脲酶酶膜，该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4.5，贮存半衰期为40天，酶活回收率为64.3%；该固定化酸性脲酶酶膜的应用：在黄酒中加入该酶膜后尿素去除率能达到73%，连续使用10次后，尿素去除率依旧可达50%。该固定化酸性脲酶酶膜产品以膜作为固定的载体，接触面积大，可以重复使用；应用于黄酒中，可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。

主权项

一种固定化酸性脲酶酶膜的制备方法，其特征在于：从肠杆菌9043C12中分离纯化提取得到酸性脲酶；将酸性脲酶溶于一定量的壳聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脱水干燥成膜，用微量戊二醛交联，得固定化酸性脲酶酶膜；其工艺为：A．酸性脲酶的提取：（1）菌种：采用实验室已有肠杆菌（Enterobacter sp.）9043C12;（2）种子培养：种子培养基成分g/L：葡萄糖 20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4  2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用去离子水定容至1L，pH7.0；接种量5%，35℃恒温静置培养18~20h；（3）发酵培养：发酵培养基成分g/L：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，用去离子水定容至1L，pH5.5；接种量5%，35℃恒温静置培养28~32 h；（4）收集菌体：将发酵液在8000r/min、4℃条件下离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，pH5.5的柠檬酸缓冲液洗涤一次，离心后所得菌体最终溶于pH5.5的柠檬酸缓冲液中，1g菌泥溶于35mL该柠檬酸缓冲液中； （5）高压破碎：850Pa条件下，每次处理量25mL，15min处理100mL的菌泥溶液；将破碎液于4℃下14500r/min离心20min，收集上清液，即为所需酸性脲酶酶液；B．固定化过程： （1）取0.8g壳聚糖溶于100mL 质量浓度1%的乙酸中，将4 mL酸性脲酶酶液溶于其中，置于磁力搅拌器上，搅匀脱泡后，双层纱布过滤，以0.3‑0.5mL滤液/cm2的量倾倒在光滑的玻璃板上，37℃自然脱水成膜，用柠檬酸缓冲液浸泡后剥离；（2）将制好的膜剪成4 cm×4 cm～10 cm×10 cm大小均匀的方块，浸泡在质量浓度0.02%的戊二醛溶液中，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，去离子水洗涤，去除游离戊二醛，沥干，所得固定化膜贮存在4℃冰箱内，备用。