[发明专利]黄花蒿的遗传转化方法

摘要

一种黄花蒿的遗传转化方法，该方法主要包括黄化蒿无菌苗的准备，菌株的活化和浸染菌液的制备，黄花蒿节间茎作为转化外植体与菌液共培养，然后把经过共培养的外植体挑出，转入到选择培养基上进行脱菌和选择培养，将选择培养基中产生的抗性植株转入到选择伸长培养基和选择生根培养基中先后进行伸长培养、生根培养，直至抗性芽再生为完整的植株。对获得的抗性植株分别进行了GUS检测和PCR检测，结果表明外源基因已经整合到黄花蒿的基因组中。本发明具有操作简单、取材方便、转化效率高，可广泛用于黄花蒿的基因工程操作中。

主权项

一种黄花蒿的遗传转化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)、黄花蒿无菌苗的准备：将黄花蒿种子灭菌后接种于1/2MS培养基上，在每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％的条件下培养，7天后转至MS培养基，每40天继代一次；2)、菌株的活化及浸染菌液的制备：将携带目的基因的农杆菌划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养两天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，取达到对数生长期的菌液即OD600为0.6‑0.7，离心，弃上清液，收集菌体悬浮于MS液体培养基中稀释OD600＝0.3，加入80‑120μmol/L乙酰丁香酮，得到用于转化的浸染液；3)、侵染和共培养：取继代苗龄为30‑40天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1‑3厘米长的茎，置于步骤2中的侵染液中，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，侵染时间为15‑30min；取出侵染过的外植体，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS培养基+100μmol/L乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48‑60h；4)、不定芽的诱导I期：将共培养后的外植体转移至添加有0.1mg/L噻二唑苯基脲、400mg/L羧苄西林及25mg/L卡那霉素的MS培养基中进行诱导培养，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；5)、不定芽的诱导II期：2周后，将步骤4中的外植体转入含300mg/L羧苄西林和25mg/L卡那霉素的MS+0.05mg/L 1‑萘乙酸+0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤培养基，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；6)、选择性伸长培养：3周后，将步骤5中的培养材料转入含300mg/L羧苄西林和25mg/L卡那霉素的MS+0.2mg/L 6‑苄氨基嘌呤培养基伸长培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；7)、诱导生根：当步骤6中的再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L羧苄西林和25mg/L卡那霉素的1/2MS+0.1mg/L1‑萘乙酸生根培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；诱导其生根，使其形成完整的黄花蒿转基因植株。