[发明专利]一种抗Cry1c晶体蛋白兔单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种抗Cry1c晶体蛋白兔单克隆抗体的制备方法。它包括高纯度Cry1c晶体蛋白作为免疫抗原免疫兔子、多抗血清效价的测定、兔子B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合、以选择性培养基进行选择性培养，经预筛、初筛、复筛过程选择阳性克隆子并大量扩增，构建重组载体并体外培养，分离并纯化获得单克隆抗体。本发明可用于ELISA，WesternBlotting等免疫学手段对Cry1c蛋白的定性或定量检测。

主权项

一种抗Cry1c晶体蛋白的兔单克隆抗体的制备方法,其特征在于它的步骤如下：1)兔子免疫    将400~600µg的免疫抗原Cry1c蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下3~6点注射2~3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用150~250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；2)细胞融合    选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8~10天后取无菌脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48％~52％的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为18%~22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为0.8×10‑6~1.2×10‑6mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3.5×10‑9~4.5×10‑9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1.4×10‑7~1.8×10‑7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)杂交瘤细胞的筛选    细胞融合后第8~12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15~19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到24孔培养板中传代培养一周；第22~26天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3~5株生长状态最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子‑20℃冻存，经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL‑4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。