[发明专利]一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的制备方法及应用

摘要

本发明属于免疫检测及生物技术领域，具体涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的制备方法及应用。利用丁基硼酸封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的7,15-羟基，戊二酸酐酰化3-羟基合成3-HG-DON，通过二环已基碳二亚胺活泼酯法将3-HG-DON偶联到载体蛋白BSA，得到人工抗原DON-HG-BSA。本发明提供的制备方法尽量避免反应副产物的生成，降低或避免蛋白对半抗原的掩蔽效应，制备过程温度条件比较温和，在10~37℃之间，避免高温条件下DON氧化而产生副产物，操作简易可行。

主权项

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原DON‑HG‑BSA的制备方法，其特征是由以下步骤构成：（1）（A）采用丁基硼酸（BBA）封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇C7和C15上的羟基，形成环状内酯DON‑BBA；（B）用戊二酸酐同C3上的羟基发生酰化反应，形成BBA‑DON‑HG，并用甲醇解封闭，形成3‑HG‑DON；（C）用DCC方法将3‑HG‑DON与BSA载体蛋白偶联，得到人工抗原DON‑HG‑BSA；（2）步骤（A）中将脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶解于无水四氢呋喃后与丁基硼酸(BBA)混合，脱氧雪腐镰刀菌烯醇与丁基硼酸的物质的量比为：1：8~10；脱氧雪腐镰刀菌烯醇与无水四氢呋喃的体积比为：0.01~ 0.02（g/mL）；室温振荡反应12‑16小时，以薄层色谱（TLC）检测监控反应程度，直至DON封闭完全，形成DON‑BBA；（3）步骤（B）中将DON‑BBA与4‑二甲氨基吡啶（DMAP）(溶于无水四氢呋喃)和戊二酸酐（HG）(溶于无水四氢呋喃)混合，DON‑BBA与DMAP和HG的物质的量比为：1：2~4：6~9，4‑二甲氨基吡啶与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2（g/mL），戊二酸酐与与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2（g/mL）；37℃振荡反应2小时后加入蒸馏水400~500µl终止反应，抽真空除去四氢呋喃；氯仿萃取3~4次，合并氯仿相，抽真空去除氯仿，将残留物溶于700~ 800µl甲醇，室温振荡反应(解封闭)12~16小时；薄层层析纯化3‑HG‑DON(展层剂为氯仿：丙酮：异丙醇=8:1:1)，紫外光下剖取Rf值小于DON的条带，甲醇洗脱收集，真空干燥得3‑HG‑DON；（4）步骤（C）中3‑HG‑DON与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS及二环已基碳二亚胺DCC混合，溶于无水四氢呋喃中，3‑HG‑DON与NHS及DCC的物质的量比为：1：0.001~0.003：0.002‑0.004；10‑14℃振荡反应8~10小时，以薄层色谱TLC检测监控反应程度；真空抽干四氢呋喃，加入200~300µl DMSO溶解，缓慢加入至1200~1300µl牛血清白蛋白溶液，15℃低速(100~120r/min)振荡反应8~10小时，用0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液透析3天，冷冻真空干燥，得到人工抗原DON‑HG‑BSA，分装4℃保存；（5）溶解载体蛋白的缓冲液为碳酸氢钠水溶液，缓冲液的浓度为0.1~0.2 mol/L，载体蛋白的质量与缓冲溶液的体积比为5~8´10‑3（g/mL）。