[发明专利]一种莱茵衣藻目标基因敲除方法

摘要

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种莱茵衣藻目标基因敲除方法方法，包括pMCS-SPA-MCS载体和pTSBIR-XIR载体的构建。本发明通过筛选对候选基因有沉默效果的转化子，利用pMCS-SPA-MCS载体自身的酶切位点，通过构建pXF-SPA-XR载体来构建目标基因RNAi载体pTSBIR-XIR，从而实现对莱茵衣藻目标基因进行沉默，具有对目标基因敲除效率高、操作简便、快捷等特点。

主权项

一种莱茵衣藻目标基因敲除方法方法，其特征在于：包括pMCS‑SPA‑MCS载体和pTSBIR‑XIR载体的构建；1)、中间载体pMD285的构建以TAKARA公司pMD‑18T Simple载体为基础，通过设计合成多克隆位点和间隔区序列，最后插入pMD‑18T Simple载体，得到中间载体pMD285；A、多克隆位点的设计选择实验室常用的TAKARA公司生产的pMD系列载体T克隆位点两端的常用内切酶位点作为间隔序列两端的酶切位点；B、间隔序列的选取以在转基因受体藻株中惰性为原则，选取pCAMBIA1302上的一段180bp在莱茵衣藻基因组中无同源性的一个片段作为间隔序列；C、两端带有多克隆位点间隔序列的合成将设计好的两端带有多克隆位点的间隔序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成，所得序列如序列表<400>1；同时，为两端带有多克隆位点的间隔序列设计一对引物：MCSF：5’‑CGCAGAATTCTGCAGATATC‑3’MCSR：5’‑GGTCGAATTCCAGCACACTG‑3’通过PCR的方法将该序列克隆到pMD‑18T Simple载体上；D、克隆载体的选取选取pMD‑18T Simple作为克隆载体；E、两端带有多克隆位点的间隔序列插入pMD‑18T Simple利用引物MCSF：5’‑CGCAGAATTCTGCAGATATC‑3’MCSR：5’‑GGTCGAATTCCAGCACACTG‑3’进行PCR扩增，回收PCR产物并连接pMD‑18T Simple载体，连接产物转化DH5α细胞，提取质粒则得到pMD285中间载体；2)、RNAi载体pTSBIR‑XIR的构建A、克隆色莱茵衣藻色氨基酸合成酶β亚基基因3’端非编码区450bp的片段；通过引物TBSF：GCACTGTGCTTTGACAGACAAG；TBSR：CGATTGGTAGCAACAAAGTGAGTPCR扩增得到TBS基因反向重复序列，分别插入载体SP124S Ble基因3’端非编码区区域，得到含TBS反向重复序列的中间载体；B、以SacI/KpnI从pSI103载体上将aphVIII gene表达框切下，补平，连入步骤1得到的中间载体，得到RNAi载体pTSBIR‑XIR。