[发明专利]胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法

摘要

本发明涉及干细胞差异膜蛋白的检测方法，旨在提供一种胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法。该方法包括：间充质干细胞的分离和培养、间充质干细胞膜蛋白的提取、双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱、质谱分析及验证。本发明首次将2D-DIGE用来对干细胞膜表面特殊差异表面标志的检测，可以在同一块凝胶上对不同样品中蛋白质进行定量比较分析，在每块凝胶中加入了内标，DIA和BVA软件可以自动地根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，最大程度上降低了不同批次胶与胶之间的误差，反应了蛋白质的真实改变程度，降低了假阳性率及假阴性率。

主权项

胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，包括以下步骤：（1）间充质干细胞的分离和培养取新鲜胎盘组织剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，使用Ficoll分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，洗两遍，收集细胞，常规培养；取新鲜脐带组织，剥离血管，剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，离心，收集细胞，常规培养；所有间充质干细胞均培养至对数生长期，用于移植；（2）间充质干细胞膜蛋白的提取反复冻融法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的组分；（3）双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱通过双向荧光差异凝胶电泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5荧光素标记的不同种类的膜蛋白凝胶图谱，采用DeCyder 2D图像分析软件进行分析，识别组间差异表达的蛋白质点；（4）质谱分析及验证选取差异蛋白质点，胶内酶解后进行质谱分析，并对MareixScience公司的Mascot网上数据库查询，鉴定差异蛋白质，寻找不同来源干细胞的特殊表面标志，然后采用Western‑Blot验证。