[发明专利]基于杜氏盐藻代谢途径的番茄红素工程菌及构建方法

摘要

本发明公开了一种基于杜氏盐藻代谢途径的番茄红素工程菌及构建方法，包括如下步骤：(1)从杜氏盐藻中获取相关基因的cDNA；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取；(3)p15A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取；(4)质粒的构建，获得番茄红素工程菌。该菌株呈粉红色，利用杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶来合成番茄红素。该菌株在2YT培养基下37℃摇瓶培养24小时的番茄红素的产率为2.6～3.2mg/g(细胞干重)。

主权项

基于杜氏盐藻代谢途径的番茄红素工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从杜氏盐藻中获取相关基因的cDNA从对数生长期的杜氏盐藻中提取总RNA，利用M‑MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得杜氏盐藻的总cDNA；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P1：5’‑CCGCTCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC‑3’和下游引物P2：5’‑ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTCTTGG‑3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3：5’‑ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA‑3’和下游引物P4：5’‑ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA‑3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5：5’‑CGACGCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG‑3’和下游引物P6：5’‑ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGAAGTG‑3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻ζ‑胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P7：5’‑GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC‑3’和下游引物P8：5’‑ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAGGAAAG‑3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子；(3)p15A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Cla I在30℃下和Hind III在37℃下对质粒pVA838处理1h后，纯化并回收DNA片段；利用T4 DNA聚合酶对获取的DNA片段进行平末端化，纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA连接酶使DNA自身环化为质粒pcmp15A，质粒pcmp15A转化大肠杆菌DH5α进行增殖；(4)质粒的构建纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在T4DNA连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒pcmp15A的DNA片段进行连接，获得质粒pDsA；依次用内切酶Xho I和Pvu I对质粒pDsA和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA在37℃下处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDsB；依次用内切酶Cla I在30℃下和Pvu I在37℃下对质粒pDsB和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDsC；依次用内切酶Mlu I和Pvu I对质粒pDsC和纯化后的杜氏盐藻ζ‑胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA在37℃下处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDscrtA；质粒pDscrtA转化大肠杆菌DH5α后获得番茄红素工程菌。