[发明专利]一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其生成方法

摘要

本发明公开了一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其高效生产方法，该方法主要包括以下步骤：克隆人源血小板源性生长因子A剪接体2基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的PDGF-A存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经CM阳离子交换柱与G-75分子筛进行高效纯化，利用CM阳离子交换法通过优化透析液的pH能够有效纯化得到其中一个PDGF-A的单体被糖基化而另一个单体未被糖基化的PDGF-AA二聚体新修饰蛋白，分离纯化的PDGF-AA二聚体新的糖基化修饰蛋白具有高度的均一性。

主权项

一种生产人血小板源性生长因子A同源二聚体的方法，其特征在于：主要包括以下步骤：(1)克隆人PDGF‑A基因：以人血小板细胞提取总mRNA为模板，先用RT‑PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整人重组PDGF‑A基因片段，所用PDGF‑A特异引物中引入Xho I酶切位点和在未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得质粒rhPDGF‑A/pMD20‑T，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαA和质粒rhPDGF‑A/pMD20‑T经过Xho I及Xba I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/PDGF‑A；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/PDGF‑A用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母GS‑115宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；将所述Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗下，经稀释后，涂布到2000μg/mL Zeocin的YPD平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基培养至光密度值＞10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导120小时后，经SDS‑PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhPDGF‑AA酵母转化子；(5)诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH 8.0透析后，利用CM阳离子交换柱于ATKA‑HPLC系统中纯化，0.13MNaCl的20mM Tris pH 8.0缓冲液漂洗后，利用PBS洗脱收集的样品，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，浓缩样品经分子筛分离，收集OD280＞50mAU的样品；收集的样品利用超滤方法浓缩，浓缩样品经分子筛分离，收集PDGF‑AA目标蛋白，最后得到纯度达97％以上的重组人PDGF‑AA蛋白。